Karakterisasi Biosurfaktan asal Bakteri sebagai Penghambat Cendawan Patogen Tanaman

Abstract

Infeksi patogen menjadi salah satu penyebab utama penyakit pada tanaman dan menjadi perhatian petani karena berkontribusi terhadap rendahnya produktivitas tanaman di berbagai daerah. Cendawan merupakan jenis fitopatogen yang sulit untuk dikendalikan. Spora seperti yang dimiliki oleh cendawan Fusarium proliferatum membuatnya mudah berdispersi dan menginfeksi tanaman, selain itu F. proliferatum juga menghasilkan beragam mikotoksin yang berkontribusi pada kerugian pascapanen. Pengendalian dengan fungisida atau bahan kimia menimbulkan pengaruh yang merugikan pada lingkungan dan kesehatan manusia jika digunakan dalam jangka panjang. Alternatif dari penggunaan bahan kimia ialah pengendalian hayati yang dapat dilakukan dengan memanfaatkan mikrob endofit ataupun mikrob yang terdapat pada rizosfer tanaman itu sendiri. Enzim dan metabolit yang dihasilkan oleh mikrob dapat dimanfaatkan untuk meningkatkan ketersediaan nutrisi, imunitas tanaman ataupun menghambat perkembangan fitopatogen. Biosurfaktan merupakan salah satu jenis metabolit sekunder dengan karakter amfipatik yang berpotensi sebagai agen anticendawan. Senyawa ini menimbulkan resistensi patogen yang lebih rendah dan memiliki biodegradibilitas serta kestabilan yang tinggi. Penelitian ini bertujuan mengekstraksi biosurfaktan dari isolat TTSG3.6 dan mengkarakterisasi ekstrak kasar biosurfaktan yang diperoleh dengan pendekatan fisik serta kimia, serta menguji kemampuannya dalam menghambat pertumbuhan cendawan fitopatogen F. proliferatum. Delapan isolat yang memiliki aktivitas anticendawan yaitu ABS4.1.2, BBP5.2.1, DBP4.1.2, ABP5.2.2, TBP5.1.3, ABP4.1.1, TTSG3.6 dan LP04 diseleksi terhadap kemampuan menghasilkan biosurfaktan dengan oil displacement assay, drop collapse assay, dan hemolysis assay. Isolat yang mempunyai potensi terbaik untuk menghasilkan biosurfaktan dan menghambat pertumbuhan cendawan F. proliferatum diidentifikasi berdasarkan gen 16S. Produksi biosurfaktan dilakukan pada media kultur mineral salt medium (MSM) menggunakan isolat terpilih, dilanjutkan dengan ekstraksi menggunakan kombinasi metode presipitasi asam dan ekstraksi pelarut. Ekstrak kasar dikarakterisasi dengan mengukur tegangan permukaan, indeks emulsifikasi, dan analisis LC-MS/MS. Kemampuan ekstrak kasar untuk menghambat pertumbuhan fitopatogen diuji dengan metode dual culture. Deteksi gen biosintetik metabolit sekunder Bacillus juga dilakukan pada penelitian ini. Isolat bakteri TTSG3.6 dan TBP5.1.3 mampu menghasilkan biosurfaktan, dilihat dari kemampuan supernatan bebas selnya membentuk zona pada oil displacement assay serta menurunkan tegangan permukaan air di atas lapisan hidrofob parafilm pada drop collapse assay. Isolat TTSG3.6 tidak dapat melisiskan sel darah merah, sedangkan isolat TBP5.1.3 bersifat hemolitik. Karakter hemolitik berkorelasi dengan keberadaan biosurfaktan, namun demikian tidak semua isolat penghasil biosurfaktan dapat melisiskan sel darah merah. Kedua isolat memliki aktivitas anticendawan terhadap F. proliferatum, yaitu sebesar 30% oleh isolat TTSG3.6 dan 60% oleh isolat TBP5.1.3. Hasil identifikasi menunjukkan isolat TTSG3.6 memiliki kemiripan dengan spesies Bacillus tequilensis sedangkan isolat TBP5.1.3 memiliki kemiripan dengan spesies Pseudomonas aeruginosa, masing-masing dengan kemiripan 99%. Genus Bacillus dan Pseudomonas dikenal sebagai penghasil biosurfaktan masing-masing untuk golongan lipopeptida serta rhamnolipid. Produksi dan ekstraksi biosurfaktan baru berhasil dilakukan menggunakan isolat TTSG3.6 sehingga karakterisasi dilakukan terhadap ekstrak kasar dari isolat tersebut. Karakteristik fisik ekstrak kasar isolat TTSG3.6 menunjukkan bahwa isolat ini mampu mereduksi tegangan permukaan hingga 29,5 mN/m serta membentuk emulsi pada oli bekas dengan indeks 37,86 ± 0,25%. Kedua karakter ini mewakili ciri-ciri biosurfaktan dari golongan lipopeptida yang bermassa molekul rendah, yaitu lebih unggul dalam menurunkan tegangan permukaan namun memiliki potensi yang lebih rendah sebagai bioemulsan. Analisis hasil skrining senyawa berbasis LC-MS/MS menunjukkan keberadaan golongan lipopeptida pada ekstrak kasar biosurfaktan yang terdiri atas jenis kurstakin, fengycin, dan surfaktin. Ketiga jenis lipopeptida ini berperan dalam bioaktivitas bakteri terutama pada aktivitas antimikrob. Deteksi gen biosintesis antibiotik Bacillus menunjukkan keberadaan gen fenA dan bacD pada isolat TTSG3.6 dan hanya gen fenA pada isolat TBP5.1.3, sedangkan 6 gen lainnya tidak terdeteksi. Gen fenA berperan dalam biosintesis fengycin, sedangkan gen bacD menunjukkan kemampuan isolat untuk memproduksi peptida bacilysin yang berperan dalam mekanisme penghambatan dinding sel mikrob. Persentase penghambatan cendawan F. proliferatum menggunakan ekstrak kasar mencapai 33% pada hari ke-10 serta lebih tinggi dibandingkan penghambatan oleh supernatan bebas sel dan sel bakteri. Kemampuan biosurfaktan asal spesies B. tequilensis menghambat pertumbuhan cendawan F. proliferatum belum ditemukan dalam penelitian sebelumnya, sehingga penelitian ini menjadi laporan pertama mengenai potensi lipopeptida asal B. tequilensis sebagai agen biokontrol F. proliferatum.

The infection of pathogens has become one of the main causes of plant diseases and a concern for farmers due to its contribution to low crop productivity in various regions. Fungi are a type of phytopathogen that is difficult to control. Spores, such as those possessed by the fungus Fusarium proliferatum, make it easily dispersed and capable of infecting plants. Additionally, F. proliferatum produces various mycotoxins contributing to post-harvest losses. Pathogen control using fungicides or chemicals has adverse effects on the environment and human health if used in the long term. An alternative to chemical use is biological control, which can be achieved by utilizing endophytic microbes or microbes present in the plant rhizosphere. Enzymes and metabolites produced by microbes can be used to enhance nutrient availability, plant immunity, or inhibit the development of phytopathogens. Biosurfactants are a type of secondary metabolite with amphipathic characteristics that have the potential to act as antifungal agents. These compounds induce lower pathogen resistance and exhibit high biodegradability and stability. This study aims to extract biosurfactants from the TTSG3.6 isolate, characterize the crude biosurfactant extract obtained through physical and chemical approaches, and test its ability to inhibit the growth of the phytopathogenic fungus F. proliferatum. Eight isolates showing antifungal activity, namely ABS4.1.2, BBP5.2.1, DBP4.1.2, ABP5.2.2, TBP5.1.3, ABP4.1.1, TTSG3.6, and LP04, were selected based on their ability to produce biosurfactants using oil displacement assay, drop collapse assay, and hemolysis assay. Isolates with the best potential for biosurfactant production and inhibition of F. proliferatum were identified based on the 16S gene. Biosurfactant production was carried out on mineral salt medium (MSM) using selected isolates, followed by extraction using a combination of acid precipitation and solvent extraction methods. The crude extract was characterized by measuring surface tension, emulsification index, and LC-MS/MS analysis. The ability of the crude extract to inhibit phytopathogen growth was tested using the dual culture method. Detection of Bacillus secondary metabolite biosynthetic genes was also performed in this study. Bacterial isolates TTSG3.6 and TBP5.1.3 were able to produce biosurfactants, as proven by the ability of their cell-free supernatant to form a zone in the oil displacement assay and reduce the surface tension of water above the hydrophobic layer of parafilm in the drop collapse assay. Isolate TTSG3.6 did not lyse red blood cells, while isolate TBP5.1.3 exhibited hemolytic activity. Hemolytic characteristics correlated with the presence of biosurfactants; however, not all biosurfactant-producing isolates could lyse red blood cells. Both isolates showed antifungal activity against F. proliferatum, with an inhibition percentage of 30% for isolate TTSG3.6 and 60% for isolate TBP5.1.3. Identification results indicated that isolate TTSG3.6 had a similarity to Bacillus tequilensis species, while isolate TBP5.1.3 had a similarity to Pseudomonas aeruginosa species, each with a similarity of 99%. The genera Bacillus and Pseudomonas are known as producers of biosurfactants, specifically lipopeptides and rhamnolipids, respectively. Production and extraction of biosurfactant were successfully carried out only using isolate TTSG3.6, so characterization was performed on the crude extract from this isolate. Physical characteristics of the crude extract from isolate TTSG3.6 showed its ability to reduce surface tension to 29.5 mN/m and form an emulsion on used oil with an index of 37.86 ± 0.25%. These characteristics represent typical features of lipopeptide biosurfactants with low molecular mass, which are superior in reducing surface tension but have lower potential as bioemulsifiers. LC-MS/MS-based compound screening results indicated the presence of lipopeptide groups in the crude biosurfactant extract, consisting of kurstakin, fengycin, and surfactin. All three types of lipopeptides play a role in bacterial bioactivity, especially in antimicrobial activity. Detection of Bacillus antibiotic biosynthesis genes showed the presence of fenA and bacD genes in isolate TTSG3.6 and only the fenA gene in isolate TBP5.1.3, while the other six genes were not detected. The fenA gene is involved in fengycin biosynthesis, while the bacD gene indicates the isolate's ability to produce bacilysin peptides that play a role in the inhibition mechanism of microbial cell walls. The percentage inhibition of F. proliferatum using the crude extract reached 33% on the 10th day of incubation and was higher than the inhibition by cell-free supernatant and bacterial cells. The ability of biosurfactants from B. tequilensis species to inhibit the growth of F. proliferatum has not been found in previous studies, making this research the first report on the potential of lipopeptides from B. tequilensis as a biocontrol agent against F. proliferatum.