Isolasi kloning dan sekuensing gen putatif enzim PQQ glukosa dehidrogenase sari Agrobacterium tumefaciens

Abstract

Enzim pirolokuinolin kuinon glukosa dehidrogenase tipe B (PQQGDH-B) merupakan enzim potensial untuk keperluan biosensor glukosa dan sampai saat ini hanya ditemukan dalam satu spesies bakteri, yaitu Acinetobacter calcoaceticus. Terdapat beberapa penelitian yang telah melaporkan peningkatan kestabilan dan aktivitas dari enzim PQQGDH-B, tetapi belum ada studi intensif yang telah dilaporkan untuk mencari PQQGDH-B dari spesies baru. Hasil analisis bioinformatika berbasis struktur telah mengidentifikasi 23 gen kandidat gen dari berbagai sumber genom bakteri yang berpotensi sebagai enzim PQQGDH-B karena homolog secara sekuens dan struktur, termasuk gen putatif PQQGDH-B dari genom Agrobacterium tumefaciens yang mempunyai nilai homologi sebesar 25%. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengkloning gen putatif PQQGDH-B dari A. tumefaciens ke Escherichia coli DH5a dengan menggunakan 2 galur A. tumefaciens yaitu LBA 4404 dan EHA 101. Isolasi genom dengan metode CTAB telah berhasil mengisolasi DNA genom dari kedua galur dengan kadar dan kemurnian yang tinggi. Teknik PCR yang dilakukan berhasil mengisolasi gen putatif PQQGDH-B berukuran 1002 pb dari kedua galur dengan menggunakan primer ATPGDH-F dan ATPGDH- R yang dirancang dari genom A. tumefaciens C58 yang telah dipublikasikan walaupun dengan pola pita yang berbeda. Diasumsikan perbedaan ini disebabkan oleh perbedaan sekuens genom galur LBA 4404 dengan EHA 101, sehingga ada kemungkinan terdapat variasi pada sekuens gen putatif PQQGDH-B yang dimiliki. Dari hasil kloning diperoleh 7 koloni E.coli-pGEM-ATPGDH rekombinan yang mempunyai gen insert putatif PQQGDH-B, tiga koloni dari gen yang berasal dari galur LBA 4404, dan sisanya dari EHA 101. Hasil sekuensing koloni 37 dari LBA 4404 menunjukkan sekuens yang identik dengan gen putatif PQQGDH-B dari A. tumefaciens yang berada di GeneBank. Gen rekombinan ini nantinya akan diekspresikan untuk mendapatkan enzim putatif PQQGDH-B.