Pemisahan kristal protein bacillus thuringiensis dengan kolom kromatografi carboxymethyl cellulose (CMC)

Abstract

Sebelum dipakai, resin CMC perlu diaktifkan terlebih dahulu dengan larutan HCl encer. Untuk mencari waktu optimum aktivasi resin CMC, resin ini direndam selama 20, 40 dan 60 menit. Waktu aktivasi optimum yang diperoleh yaitu 60 menit kemudian dipakai untuk semua percobaan selanjutnya. Untuk memisahkan kristal protein Bacillus thuringiensis subsp. aizawai (Bta), sebanyak 100 µl suspensi spora-kristal (± 5,99x10 kristal/ml) ditaruh di atas kolom CMC (2 cm) yang sudah diaktifkan di dalam buret 50 ml. Spora dan serpihan sel berhasil dicuci dari kolom dengan menggunakan larutan penyangga Na-asetat pH 5 dan larutan penyangga K-fosfat pH 7. Untuk melepaskan kristal yang terikat pada kolom dipakai larutan penyangga Tris-EDTA. Di antara empat macam pH larutan penyangga ini yang dicobakan sebagai eluan, ternyata sejumlah kristal terelusi pada pH 8,0. Ketika percobaan diulang dengan menggunakan larutan penyangga Tris-EDTA PH 8,0 saja, diperoleh kristal sebanyak 5,86x10 kristal/ml (97,8% recovery). Perolehan kristal dalam penelitian ini jauh lebih tinggi daripada yang diperoleh beberapa peneliti lain. Pengujian kualitas kristal dari segi toksisitasnya terhadap larva Spodoptera litura instar-2 menunjukkan mortalitas larva yang lebih rendah dibandingkan dengan mortalitas yang disebabkan oleh perlakuan campuran spora-kristal maupun Florbac Fc. Diketahui bahwa untuk Bta, spora memang dapat meningkatkan toksisitas kristal protein Cry IC Secara keseluruhan, penggunaan resin CMC yang masih tersedia di pasaran (0,6 meq/g; medium mesh) dapat menggantikan CMC yang sudah tidak tersedia lagi di pasaran (0,7 meq/g; fine mesh), bahkan hasil perolehan kristalnya lebih tinggi. Waktu aktivasi resin seharusnya dapat dipersingkat dengan menggunakan larutan HCl yang lebih pekat. Larutan penyangga Tris-EDTA pH 8 terbukti dapat mengelusi kristal protein Bta dengan baik.