Deteksi gen nitrilase sebagai pelacak keberadaan Rhodococcus pendegradasi nitril pada komunitas mikroba asosiasi spons

Abstract

Biodegradasi nitril telah lama dikaji dan semakin intensif, hal ini sehubungan dengan peranan sistem biokonversi nitril yang banyak diaplikasikan sebagai agen biokatalis dalam menghasilkan berbagai senyawa kimia intermediat. Salah satu enzim yang terlibat dalam biodegradasi nitril adalah nitrilase (EC 3.5.5.1) yang berfungsi menghidrolisis nitril menjadi asam karboksilat dengan melepaskan amonium. Nitrilase telah banyak dipakai di industri, salah satu contohnya adalah produksi lipitor sebagai senyawa statin yang berfungsi menurunkan tingkat kolesterol oleh Pfizer. Meningkatnya perhatian kepada nitrilase mendorong usaha-usaha eksplorasi untuk mendapatkan sumberdaya genetik nitrilase, karena masih terbuka peluang besar untuk menemukan nitrilase dengan aktivitas dan tingkat kestabilan yang tinggi. Kelompok bakteri yang banyak dilaporkan sebagai pendegradasi nitril yang unggul adalah Rhodococcus, sehingga kemungkinan besar berpotensi menyimpan sumber daya genetik nitrilase dengan kemampuan tinggi. Eksplorasi yang dilakukan untuk mendapatkan nitrilase umumnya dari daerah yang tercemar atau terpapar limbah nitril yang terbatas pada wilayah daratan (terestrial), dan masih jarang yang melakukan dari lingkungan laut. Sebagai bakteri Gram positif Rhodococcus memiliki daya tahan hidup yang luar biasa hingga mampu hidup di lingkungan yang cukup ekstrim, termasuk di daerah dengan kadar salinitas yang tinggi. Hal ini terungkap dari penelitian yang menemukan spesies Rhodococcus hidup di dasar (sedimen) laut dalam, sehingga potensi menemukan bakteri tersebut di lingkungan laut terbuka luas. Salah satu potensi sumber daya mikroba di laut adalah mikroba asosiasi spons, yang telah banyak diteliti menyimpan banyak potensi untuk bidang farmasi dan kimiawi. Tingginya komposisi mikroba dalam tubuh spons yang mencapai 40-60% dari bobot tubuh spons menjadikan spons tampak sebagai fermentor alami, dengan kepadatan mikroba mencapai 109 sel/ml spons merupakan peluang besar untuk digali potensinya. Penelitian ini bertujuan untuk melacak Rhodococcus sebagai bakteri pendegradasi nitril yang hidup sebagai bakteri asosiasi spons, dengan cara melacak keberadaan gen nitrilase sebagai salah satu enzim yang berperan dalam sistem biodegradasi nitril mikrobial. Metode yang dipakai didasarkan atas reaksi polimerase chain reaction (PCR) menggunakan primer spesifik untuk gen target, sehingga diperlukan primer yang tepat agar bisa mengamplifikasi gen nitrilase dari DNA genom total bakteri asosiasi spons. Untuk mendapatkan primer yang tepat diperlukan DNA acuan sebagai template bagi pengujian primer hasil desain, oleh karena itu langkah pertama yang dilakukan adalah penapisan untuk menemukan isolat kontrol positif dari kelompok Rhodococcus. Penapisan dilakukan dengan menggunakan media selektif yang hanya memakai senyawa nitril sebagai satu-satunya sumber nitrogen, karbon dan energinya. Isolat yang mampu tumbuh menandakan mampu mendegradasi senyawa nitril dan memiliki sistem enzim pendegradasi nitril.

Nitrilase, an hydrolizing enzyme that convert nitrile compounds into corresponding carboxilic acid, is important enzyme for producing several intermediate compounds. Related to stability as an encounter problem of nitrilase, it is required new genetic resources to acquire the better enzyme. Related to megabiodiversity of Indonesia’s natural resources, one of potential sources to be explored is from sponge-microbe association. Gene encoded nitrilase was screening by PCR method with H1 primer that designing based on Rhodococcus genus that known as superior nitrile degrading bacteria. Formerly determining positive control isolate, and TPIK isolate that previously identified as Rhodococcus pyridinivorans was selected. Amplification to the positive control isolate (TPIK) was resulted 914 bp fragment which identified as nitrilase gene that 98% has similar with nitrilase gene from Rhodococcus rhodochrous tg1-A6. Amplification to the total genome DNA of sponge-associated microorganism acquired 6 sponge samples that positive contains of microbe encoded nitrilase gene. Amplification to the culture of sponge-associated microorganism gained only one positive sample, identified as nitrilase gene similar with nitrilase from Rhodococcus sp. BX2. This result suggested that Rhodococcus as nitrile degradaing enzyme can be found live as sponge-associated microorganism, but mostly are unculturable bacteria.