Ekstraksi Senyawa Bioaktif Bacillus subtilis dan Uji Efikasi Nanoemulsinya dalam Pengendalian Penyakit Tanaman

Abstract

Genus Bacillus memiliki beragam senyawa bioaktif berspektrum luas, termasuk B. subtilis. B. subtilis menunjukkan aktivitas anticendawan yang kuat terhadap cendawan patogen penyebab penyakit pada tanaman pangan. Penggabungan senyawa bioaktif yang diperoleh dari metabolit sekunder bakteri dengan nanoteknologi merupakan strategi yang menjanjikan untuk pengendalian penyakit tanaman. Pemanfaatan senyawa bioaktif asal bakteri biokontrol sudah cukup banyak dilaporkan sebelumnya. Namun, informasi yang memanfaatkan penggunaan sistem nanocarrier untuk membawa senyawa bioaktif sebagai fungisida masih sangat terbatas. Penelitian ini bertujuan mengeksplorasi senyawa anticendawan asal bakteri biokontrol dan pengembangan fungisida berbasis nanoemulsi senyawa bioaktif sebagai penanganan penyakit tanaman. Penelitian ini secara garis besar terbagi dalam tiga bagian. Bagian pertama adalah ekstraksi, fraksinasi, dan identifikasi senyawa bioaktif asal bakteri biokontrol, B. subtilis strain W3.15 dan CR.9. Kedua strain bakteri tersebut diketahui memiliki aktivitas penghambatan in vitro terhadap pertumbuhan Fusarium oxysporum f. sp. glycines (Fog) IPBCC 11 712. Medium kultivasi terbaik terkait aktivitas anticendawan didapatkan pada medium basal nutrient broth (NB) dan potato dextrose broth (PDB). Senyawa anticendawan terbaik diperoleh dari ekstrak etil asetat yang dikonfirmasi dengan uji poisoned food terhadap Fog. Kromatografi lapis tipis (KLT) dan bioautografi ekstrak kasar EA mengungkapkan beberapa fraksi aktif, dimana fraksi dengan Rf 0,92 (strain W3.15) dan Rf 0,91 (strain CR.9) menunjukkan aktivitas penghambatan terkuat. Kandidat senyawa anticendawan, sphingofungin E dan makrolaktin, terdeteksi dari analisis LC-MS/MS ekstrak fraksi aktif dari masing-masing strain bakteri. Setelah didapatkan ekstrak senyawa bioaktif dengan aktivitas anticendawan terbaik terhadap Fog pada bagian pertama, dilakukan eksplorasi pengaruh aktivitas anticendawan tersebut pada hifa Fog pada bagian kedua. Hasil penelitian pada bagian kedua ini mengungkapkan dosis fungitoksisitas (IC50, konsentrasi hambat minimum (KHM), dan konsentrasi fungisidal minimum (KFM)) fraksi aktif kedua strain. Sifat fungistatis dan fungisidal fraksi aktif W3.15 dan CR.9 diketahui dari nilai KHM dan KFM yang didapatkan pada nilai 200 dan 250 ppm. Hifa Fog merespon keberadaan fraksi aktif dengan membentuk struktur untuk survival, meskipun terdapat bagian-bagian hifa yang juga mengalami kerusakan. Fraksi aktif juga membuat kerusakan pada membran sel hifa yang ditandai dengan akumulasi senyawa peroksidasi lipid. Akumulasi senyawa peroksidasi lipid berkaitan dengan cekaman oksidatif yang dipicu keberadaan fraksi aktif ditunjukkan dengan peningkatan kadar malondialdehid (MDA) pada Fog bila dibandingkan kontrol tanpa perlakuan. Kenaikan kandungan asam nukleat dan protein bebas setelah perlakuan fraksi aktif bakteri menunjukkan kerusakan membran pada hifa Fusarium. Bagian terakhir, setelah pengujian senyawa bioaktif secara in vitro berhasil dilakukan, fraksi aktif kedua strain diformulasi dalam sistem nanoemulsi dan diujikan pada tanaman. Formula nanoemulsi M/A fraksi aktif strain W3.15 dan CR.9 dibuat dengan medium chain triglycerides (MCT) dan Tween-80 sebagai fase minyak. Formula nanoemulsi terbaik didapatkan dari formula dengan rasio 2:1 (MCT-ekstrak:Tween-80) menunjukkan ukuran yang homogen dan stabil selama 25 hari tanpa creaming, sedimentasi, dan pembentukan double layer. Selain itu, perlakuan dengan nanoemulsi terbaik kedua strain bakteri menunjukkan efikasi yang tinggi dalam menekan stunting dan layu Fusarium pada tanaman kedelai yang disebabkan oleh infeksi Fog. Keefektifan nanoemulsi M/A fraksi aktif CR.9 secara nyata lebih tinggi bila dibandingkan hasil yang didapatkan darifungisida komersial, Dithane M-45. Secara keseluruhan, senyawa bioaktif W3.15 dan CR.9 dengan sistem nanoemulsi berpotensi sebagai alternatif fungisida dalam strategi pengendalian penyakit tanaman. Oleh karena itu, hasil penelitian ini dapat menjadi dasar untuk pengembangan strategi potensial dalam penelitian biokontrol penyakit tanaman. Berdasarkan uraian tersebut, kebaharuan dari penelitian ini meliputi, pertama, memberikan informasi terkait kandidat senyawa anticendawan non-polar, nonvolatil dan nonenzim asal B. subtilis strain W3.15 dan CR.9, berupa poliketida makrolaktin, yang jarang dilaporkan pada B. subtilis. Kedua, menyediakan informasi terkait dosis bioaktivitas (IC50, fungistatis-fungisidal) senyawa anticendawan asal strain W3.15 dan CR.9. Ketiga, senyawa anticendawan B. subtilis strain W3.15 dan CR.9 berperan dalam menginduksi akumulasi senyawa indikator cekaman selular dan kerusakan sel patogen. Keempat, menyediakan informasi formulasi nanoemulsi minyak dalam air (m/a) dari ekstrak bakteri dengan minyak MCT-Tween 80 pada rasio 2:1. Kelima, yaitu peran nanoemulsi ekstrak asal bakteri dalam keberhasilan penekanan penyakit layu pada tanaman kedelai secara in vitro.