engklonan Gen Protease Serupa Subtilisin dari Bacillus pumilus YI ke dalam Escherichia coli DH5a,

Abstract

Studi pelacakan dengan menggunakan gen kimotripsin dari fragmen BamHl plasmid pJB, diperoleh hasil bahwa tidak satupun Bacillus sp. yang diisolasi dari Indonesia, termasuk Bacillus pumilus YI, memiliki gen penyandi serupa kimotripsin. Ristiarini (1996) telah melokalisir gen penyandi enzim protease serupa subtilisin pada Bacillus pumilus YI dengan menggunakan metode hibridisasi southern. Gen serupa subtilisin tersebut terdapat pada fragmen DNA genom hasil digesti EcoRI yang berukuran 3 kb. Pada penelitian ini dilakukan pengklonan gen penyandi enzim serupa subtilisin ke dalam Escherichia coli DH5a dengan menggunakan vektor pUC 19. Dari hasil pengklonan diperoleh beberapa koloni putih., yang setelah direplika pada media yang mengandung skim (skim milk agar ) diperoleh empat koloni putih yang menghasilkan halo yang tipis setelah diinkubasi selama 4 hari pada suhu 37°C. Hasil verifikasi plasmid diperoleh adanya beberapa DNA sisipan (insert) dengan ukuran yang berbeda, yaitu 0.3 kb, 0,9 kb, 1,5 kb, 2.4 kb, 2,6 kb, 2, 7 kb, dan 3,0 kb. Plasmid-plasmid rekombinan ini dilµbridisasi dengan menggunakan pelacak gen subtilisin dari fragmen .&oRI plasmid pPT30. Dua dari plasmid rekombinan ini menghasilkan signal positif dengan ukuran 2.4 kb, 2.6 kb, dan dua plasmid rekombinan lainnya berukuran hampir sama yaitu 3 kb. Dengan demikian gen penyandi enzim protease serupa subtilisin dari Bacillus pumi/us YI telah terklon dan plasmid rekombinannya berturut-turut disebut : pBNI, pBN2, pBN3, dan pBN4. Selama pertumbuhan pada Luria broth pada suhu 37°C, E. coli rekombinan rnenghasilkan aktivitas protease tertinggi yaitu 0.2307 U/ml setelah 15 jam fermentasi, dan secara umum protease yang dihasilkan bersifat sensitif terhadap PMSF.