Deteksi Chrysanthemum B carlavirus dari Stek Krisan

Abstract

Krisan merupakan salah satu tanaman hias yang memiliki nilai ekonomi yang cukup tinggi karena memiliki daya tarik warna, bentuk, dan ukuran yang beranekaragam sehingga diminati masyarakat. Tanaman induk (mother plant) banyak diimpor dari negara Jepang dan Belanda, sedangkan stek hibrid banyak diekspor ke negara Jepang, Belanda, Hong Kong, dan Taiwan. Kendala utama dalam budidaya krisan adalah infeksi Chrysanthemum B carlavirus (CVB) yang dapat menyebabkan penurunan kualitas bunga. Oleh karena itu sangat penting mendapatkan metode yang baik untuk mendeteksi CVB dari bahan propagasi seperti stek, khususnya sebelum stek tersebut ditanam. Penelitian bertujuan untuk mendeteksi virus pada stek krisan impor dengan metode indirect ELISA, serta mengevaluasi empat metode ekstraksi RNA total untuk mendeteksi CVB dari stek krisan menggunakan metode RT-PCR. Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor (IPB) dari bulan Desember 2011 sampai dengan April 2012. Sampel yang digunakan adalah stek krisan impor, ekspor, dan asal petani. Deteksi dengan indirect ELISA menggunakan antibodi CVB, Cucumber mosaic cucumovirus (CMV), Potato virus Y (PVY), dan Tomato spotted wilt tospovirus (TSWV). Inokulum CVB diperbanyak pada krisan sehat dengan penularan mekanis, kemudian tiga bagian stek yang berbeda (batang, tangkai daun, dan daun) dari krisan hasil inokulasi tersebut diekstraksi dengan empat metode ekstrasi RNA total yaitu metode Wylie, Simple Direct Tube (SDT), Simple Extraction Method (SEM), dan kit komersial RNeasy plant mini kit. RNA total hasil ekstraksi diukur kemurnian dan konsentrasinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 dan 280 nm. RNA total digunakan untuk deteksi CVB dengan RT-PCR menggunakan sepasang primer spesifik gen protein selubung yaitu CVB5 (5’-CAAAGAGGTGATCATCCGTCTAG-3’) (forward) dan CVB3 (5’-CTCGGTTAC TTTATCGCACCTAG3’) (reverse) dan sepasang primer kontrol internal RubiscoL yaitu RBCL-F535 (5’-CTTTCCAAGGCCCGCCTCA-3’) (forward) dan RBCL-R705 (5’-CATCATCTTTGGTAAAATCAAGTCCA-3’) (reverse). DNA CVB hasil amplifikasi RT-PCR berukuran 739 bp dan DNA kontrol internal RubiscoL berukuran 171 bp. Berdasarkan hasil indirect ELISA CVB, CMV, PVY, dan TSWV tidak terdeteksi pada stek impor, ekspor, sampel asal petani di Ciawi (Bogor) dan Cugenang (Cianjur). Sampel asal Cipanas (Cianjur) dan Sukaraja (Sukabumi) menunjukkan reaksi positif terhadap antibodi CVB dengan insidensi berturut-turut sebesar 25% dan 1% namun bereaksi negatif terhadap tiga antibodi lainnya. Hasil RT-PCR menunjukkan bahwa pita DNA CVB berhasil diamplifikasi dengan baik dari RNA template asal batang, tangkai daun, dan daun menggunakan metode Wylie; metode SEM dan kit komersial berhasil mengamplifikasi CVB dari sampel tangkai daun, dan daun; metode SDT tidak berhasil mengamplifikasi CVB dari semua bagian stek. Kualitas RNA total hasil ekstraksi dengan SEM memiliki kemurnian dan konsentrasi yang lebih baik dibandingkan kit komersial. Walaupun demikian pita DNA CVB berhasil teramplifikasi pada RT-PCR menggunakan RNA total hasil ekstraksi dengan kit komersial yaitu pada volume...dst