Deteksi dan Identi:fikasi Gen Kitinase pada Trichoderma harzianum DT038

Abstract

T harzianum telah dikenal sebagai agen biokontrol potensial yang mengeluarkan sejumlah enzim kitiiiolitik, seperti kitinase. Enzim kitinase berperan penting dalam pengendalian cendawan patogen tanaman. Tujuan dari studi ini adalah untuk mendeteksi dan mengidentifikasi gen kitinase pada T. harzianum DT038. Deteksi gen kitinase pada T. harzianum DT038 dilakukan dengan PCR menggunakan primer spesifik ChilF 5'GCAATTCACCATGTTGAGC3' dan ChilR 5'GCGCCTGAAATTAGGCAG3'. Primer tersebut dirancang berdasarkan sekuen gen endokitinase Chil pada T harzianum. Analisis PCR menghasilkan pita amplifikasi yang berukuran sekitar 1,4 kb. Kloning produk PCR pada sel inang Escherichia coli dilakukan dengan menggunakan vektor pGEM-T Easy. Skrining berdasarkan metode biru putih menghasilkan 30 koloni putatif rekombinan. Diantara koloni-koloni tersebut hanya 5 koloni yang memberikan basil positif pada analisis PCR menggunakan primer ChilF dan ChilR. Sekuensing produk dan klon PCR dilakukan secara bertahap menggunakan 7 buah primer, 2 primer universal (T7 dan SP6) serta 5 primer spesifik (ChilF, ChiFa, ChiFe, ChiR.f, ChilR). Primer tersebut dirancang berdasarkan sekuen gen endokitinase Chil dan sekuen T. harzianum DT03. Sek.'l.lensing terhadap sekuen T. harzianum DT038 menghasilkan susunan nukleotida yang terdiri atas 1485 pb. Analisis kemiripan dengan menggunakan program BLAST menunjukkan bahwa sekuen T. harzianum DT038 memiliki nilai kemiripan yang tinggi dengan gen endokitinase dari Trichoderma spp lain di GenBank. Nilai kemiripan tertinggi diperoleh pada penjajaran antara sekuen T. harzianum DT038 dengan gen endokitinase Chi-Harl dari T. harzianum (skor bits 2813; E value 0,0; 99%), gen endokitinase Chi-Virl dari T. viridae (skor bits 2789; E value 0,0; 99%), gen endokitinase Chil dari T. harzianum (skor bits 1955; E value 0,0; 98%) dan gen endokitinase Chit42 dari T. harzianum (skor bits 1891; E-Value 0,0; 98%). Multiple alignment diantara sekuen-sekuen tersebut menunjukkan adanya 3 intron. Pada sekuen T. harzianum DT038 letak intron berada pada posisi nukletida no. 158 - 212, 311 - 379, dan 426 - 484. Posisi kodon awal dan kodon akhir berada pada nukleotida no. 12 dan 1464. Sekuen ini menyandikan pembentukan 424 asam amino.