Metabolomik Rempah Minor Indonesia Famili Zingiberaceae dan Potensinya Sebagai Imunostimulan

Abstract

Sistem imun berfungsi sebagai pertahanan tubuh melawan infeksi patogen atau zat asing seperti virus, bakteri, parasit, protein asing dan fungi, sehingga dapat mencegah berbagai penyakit. Imunostimulan adalah molekul atau senyawa yang dapat meningkatkan sistem imun dan dapat diperoleh secara sintesis atau diekstrak dari bahan alam seperti rempah-rempah. Penentuan aktivitas imunostimulan dapat dilakukan secara in vitro melalui kultur sel limfosit. Sel limfosit adalah bagian sel darah putih yang berfungsi sebagai indikator peningkatan respon imun. Sel limfosit dapat mengalami proliferasi atau perbanyakan sel akibat adanya antigen atau mitogen dan juga komponen aktif yang berfungsi sebagai mitogen. Proliferasi sel limfosit oleh senyawa inducer akan merangsang berbagai reaksi biokimia di dalam sel limfosit sehingga menghasilkan produksi interleukin-2 (IL-2). IL-2 merupakan sitokin yang berperan dalam meningkatkan aktivasi, proliferasi dan diferensiasi limfosit T dan limfosit B. Sistem imun spesifik bekerja dengan baik ditandai dengan peningkatan kadar IL-2. Zingiberaceae merupakan salah satu famili tanaman rempah yang berpotensi meningkatkan sistem imun. Beberapa komponen aktif dari spesies Zingiberaceae yang memiliki aktivitas imunostimulan adalah gingerol dan shogaol pada jahe (Zingiber officinale Roscoe), senyawa α-turmerone dan ar-turmerone pada kunyit (Curcuma longa L) dan senyawa kuersetin pada lengkuas (Alpinia galanga Linn). Spesies rempah Zingiberaceae tersebut sering dimanfaatkan oleh masyarakat Indonesia terutama bagian rimpangnya sebagai bumbu masakan (penyedap rasa, pengawet, pewarna dan elemen aromatik) sehingga disebut sebagai rempah mayor. Namun, ada sejumlah spesies Zingiberaceae yang lain yaitu bangle (Zingiber purpureum Roscoe), bangle hitam (Zingiber ottensii Val), kapulaga (Amomum compactum Sol. ex Maton), laja gowah (Alpinia malaccensis Burm. f), lempuyang wangi (Zingiber aromaticum Val), lempuyang (Zingiber zerumbet L. Roscoe ex Sm), temu putih (Curcuma zedoria Roscoe), temu hitam (Curcuma aeruginosa Roxb), temu giring (Curcuma heyneana Val. & Zijp), temu kunci (Boesenbergia rotunda L. Mansf), temu putri (Curcuma petiolata Roxb) dan temu tis (Curcuma purpurascens Blume) yang dikategorikan sebagai rempah minor, karena masih kurang pemanfaatannya terutama sebagai bumbu masakan akan tetapi sudah banyak digunakan dalam pengobatan tradisional. Penelitian terkait aktivitas imunostimulan, identifikasi senyawa imunostimulan dan senyawa yang dapat meningkatkan kadar IL-2 dari rempah-rempah minor menggunakan pendekatan metabolomik masih sangat terbatas, sehingga perlu dikaji secara ilmiah. Tujuan penelitian ini adalah (1) melakukan penapisan 12 rempah minor famili Zingiberaceae berdasarkan aktivitas imunostimulan melalui uji proliferasi sel limfosit yang dihitung sebagai nilai indeks stimulasi (IS); (2) menentukan satu rempah dengan nilai IS tertinggi untuk proses fraksinasi dengan berbagai macam pelarut; (3) mengevaluasi masing-masing fraksi terhadap aktivitas proliferasi limfosit, kadar interleukin-2 (IL-2) dan profil kimia kromatogram dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC); (4) mengkorelasikan data profil kimia kromatogram berupa selang waktu retensi dengan data aktivitas proliferasi limfosit dan aktivitas IL-2 menggunakan Orthogonal Projection to Least Square Analysis (OPLS) dengan tujuan untuk memperoleh selang waktu retensi yang paling berkorelasi dengan aktivitas proliferasi limfosit dan aktivitas IL-2 dari fraksi teraktif; (5) mengidentifikasi senyawa yang dapat meningkatkan proliferasi limfosit dan kadar IL-2 dari selang waktu retensi fraksi teraktif berbasis metabolomik dengan OPLS menggunakan Ultra High-Performance Liquid Chromatography High Resolution Mass Spectrometry (UHPLC-HRMS). Hasil penelitian tahapan penapisan aktivitas imunostimulan dari 12 rempah minor Zingiberaceae menunjukkan ekstrak laja gowah (Alpinia malaccensis) dan bangle hitam (Zingiber ottensii) memiliki nilai indeks stimulasi limfosit (IS) paling tinggi dibandingkan ekstrak rempah minor lainnya yaitu berturut-turut sebesar 2,42 ± 0,17 dan 2,37 ± 0,97 pada konsentrasi ekstrak di dalam sumuran kultur sel limfosit sebesar 80 ppm dan berdasarkan uji lanjut DMRT indeks stimulasi limfosit dari kedua ekstrak tidak berbeda nyata. Akan tetapi, rempah yang dipilih ke tahapan fraksinasi adalah laja gowah (Alpinia malaccensis) karena ketersediaan rempahnya lebih banyak dan secara sensori aromanya lebih harum dibandingkan bangle hitam. Fraksi metanol rimpang laja gowah memiliki indek stimulasi limfosit dan kadar IL 2 paling tinggi dibandingkan fraksi heksana, kloroform, etil asetat dan air, yaitu berturut-turut sebesar 1,20 ± 0,15 dan 3,98 pg/mL. Hubungan aktivitas proliferasi limfosit berkorelasi kuat positif dengan kadar IL-2 berdasarkan uji korelasi pearson. Hasil plot skor OPLS aktivitas proliferasi limfosit dan aktivitas IL-2 menunjukkan fraksi aktif dan fraksi tidak aktif terpisah dan mengelompok sesuai dengan aktivitasnya. Fraksi aktif adalah fraksi metanol dan air berada di kuadran sebelah kanan, sedangkan fraksi tidak aktif adalah fraksi heksana, kloroform dan etil asetat berada di kuadran sebelah kiri. Selang waktu retensi 27,0-28,5 menit pada S-plot berdasarkan aktivitas proliferasi limfosit dan aktivitas IL-2 dominan terdapat pada fraksi aktif metanol. Selang waktu retensi 27,0-28,5 menit juga memiliki nilai Y-related coefficient dan VIP yang tinggi, baik itu pada model OPLS aktivitas proliferasi limfosit maupun aktivitas IL-2. Validasi model OPLS berdasarkan aktivitas proliferasi limfosit dan IL-2 dengan plot permutasi secara signifikan valid dan bagus karena nilai R2Y dan Q2Y dari kedua model permutasi lebih rendah dibandingkan model sebenarnya. Identifikasi senyawa yang mampu meningkatkan aktivitas proliferasi limfosit dan IL-2 dilakukan dengan mencocokkan pola kromatogram fraksi metanol laja gowah dari HPLC dan UHPLC-HRMS. Hasil kromatogram HPLC pada selang waktu retensi 27,0-28,5 menit terdapat satu puncak senyawa yaitu pada waktu retensi 27,71 menit. Puncak tersebut memiliki pola puncak yang sama pada selang waktu retensi 21,15 menit pada kromatogram UHPLC-HRMS. Berdasarkan pola fragmentasi dari spektra massa UHPLC-HRMS, senyawa yang mampu meningkatkan aktivitas proliferasi limfosit dan IL-2 adalah flavokawain B karena memiliki ion molekul (M+) sebesar 285 m/z dan ion fragmen (m/z) adalah 181, 166, 131 dan 103. Ion fragmen tersebut sesuai dengan spektra massa flavokawain B dari Human Metabolome Database (HMDB) PubChem. Flavokawain B sebelumnya telah dilaporkan mampu meningkatkan proliferasi splenosit tikus dan meningkatkan produksi IL-2 secara in vivo.