Perakitan Tanaman Kentang Atlantik Transgenik yang Mengandung CRISPR/Cas9-gRNAepsps untuk Pengeditan Gen 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase

Abstract

Gulma dapat menyebabkan penurunan hasil produksi tanaman kentang yang berkisar 19-81%. Gulma menjadi kompetitor tanaman dan dapat menjadi inang bagi serangga dan patogen yang dapat menular pada tanaman budidaya. Penggunaan herbisida merupakan salah satu cara yang sangat efektif, efisien dan ekonomis dalam pengendalian gulma. Herbisida yang mengandung bahan aktif glifosat banyak digunakan oleh petani. Glifosat menghambat enzim 5- enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase (EPSPS) yang berperan dalam sintesis asam amino aromatik yaitu fenilalanin, tirosin dan triptopan. Tanaman yang mengandung EPSPS mutan menjadi resisten terhadap glifosat karena EPSPS mutan tidak dikenali oleh glifosat. Pengeditan gen melalui sistem CRISPR/Cas9 dapat digunakan untuk melakukan mutasi secara terarah pada gen epsps. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengkonstruksi vektor ekspresi yang mengandung CRISPR/Cas9-gRNAepsps dan merakit tanaman kentang kultivar Atlantik transgenik yang mengandung transgen CRISPR/Cas9-gRNAepsps. Sekuen gRNA dirancang berdasarkan cDNA gen epsps Solanum tuberosum (Acc: LOC102600915). Sekuen gRNA yang sudah ditambah dengan situs AarI pada kedua ujung 5’ diligasikan dengan vektor pDIRECT_21A untuk membentuk vektor rekombinan pDIRECT_21A-gRNAepsps. Vektor pDIRECT_21A gRNAepsps diintroduksikan ke dalam A. tumefaciens strain EHA 105. A. tumefaciens yang mengandung pDIRECT_21A-gRNAepsps digunakan untuk menginokulasi potongan daun kentang atlantik untuk menghasilkan tanaman transgenik putatif. Tanaman transgenik putatif selanjutnya dianalisis secara molekuler dengan PCR untuk mengetahui integrasi transgen Cas9-gRNAepsps di tanaman kentang transgenik. Hasil penelitian menunjukkan bahwa gRNA dari gen epsps telah berhasil dirancang dan ditambah dengan situs AarI, serta disisipkan di daerah T-DNA dari plasmid pDIRECT_21A, menghasilkan pDIRECT_21A-gRNAepsps. Inokulasi tanaman kentang kultivar Atlantik dengan A. tumefaciens EHA105 yang mengandung pDIRECT_21A-gRNAepsps menghasilkan 13 tanaman kentang transgenik putatif yang resisten terhadap higromisin dengan efisiensi transformasi dan regenerasi masing-masing 2,8% dan 76,4%. Analisis PCR tanaman kentang transgenik putatif menunjukkan bahwa 10 dari 13 galur adalah kentang transgenik yang mengandung gen Cas9 dan 6 klon diantaranya mengandung Cas9-gRNAepsps.