Perakitan Tanaman Kentang Atlantik Transgenik yang Mengandung CRISPR/Cas9-gRNAepsps untuk Pengeditan Gen 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase
Abstract
Gulma dapat menyebabkan penurunan hasil produksi tanaman kentang yang
berkisar 19-81%. Gulma menjadi kompetitor tanaman dan dapat menjadi inang bagi
serangga dan patogen yang dapat menular pada tanaman budidaya. Penggunaan
herbisida merupakan salah satu cara yang sangat efektif, efisien dan ekonomis
dalam pengendalian gulma. Herbisida yang mengandung bahan aktif glifosat
banyak digunakan oleh petani. Glifosat menghambat enzim 5-
enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase (EPSPS) yang berperan dalam sintesis
asam amino aromatik yaitu fenilalanin, tirosin dan triptopan. Tanaman yang
mengandung EPSPS mutan menjadi resisten terhadap glifosat karena EPSPS mutan
tidak dikenali oleh glifosat. Pengeditan gen melalui sistem CRISPR/Cas9 dapat
digunakan untuk melakukan mutasi secara terarah pada gen epsps. Tujuan dari
penelitian ini adalah untuk mengkonstruksi vektor ekspresi yang mengandung
CRISPR/Cas9-gRNAepsps dan merakit tanaman kentang kultivar Atlantik
transgenik yang mengandung transgen CRISPR/Cas9-gRNAepsps.
Sekuen gRNA dirancang berdasarkan cDNA gen epsps Solanum tuberosum
(Acc: LOC102600915). Sekuen gRNA yang sudah ditambah dengan situs AarI
pada kedua ujung 5’ diligasikan dengan vektor pDIRECT_21A untuk membentuk
vektor rekombinan pDIRECT_21A-gRNAepsps. Vektor pDIRECT_21A gRNAepsps diintroduksikan ke dalam A. tumefaciens strain EHA 105. A.
tumefaciens yang mengandung pDIRECT_21A-gRNAepsps digunakan untuk
menginokulasi potongan daun kentang atlantik untuk menghasilkan tanaman
transgenik putatif. Tanaman transgenik putatif selanjutnya dianalisis secara
molekuler dengan PCR untuk mengetahui integrasi transgen Cas9-gRNAepsps di
tanaman kentang transgenik.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa gRNA dari gen epsps telah berhasil
dirancang dan ditambah dengan situs AarI, serta disisipkan di daerah T-DNA dari
plasmid pDIRECT_21A, menghasilkan pDIRECT_21A-gRNAepsps. Inokulasi
tanaman kentang kultivar Atlantik dengan A. tumefaciens EHA105 yang
mengandung pDIRECT_21A-gRNAepsps menghasilkan 13 tanaman kentang
transgenik putatif yang resisten terhadap higromisin dengan efisiensi transformasi
dan regenerasi masing-masing 2,8% dan 76,4%. Analisis PCR tanaman kentang
transgenik putatif menunjukkan bahwa 10 dari 13 galur adalah kentang transgenik
yang mengandung gen Cas9 dan 6 klon diantaranya mengandung Cas9-gRNAepsps.