Kajian Senyawa Antimikroba Bakteri Asam Laktat Heterofermentatif Isolat ASI

Abstract

Bakteri asam laktat (BAL) dapat menghasilkan metabolit berupa senyawa yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba pembusuk dan patogen. Senyawa antimikroba yang dihasilkan oleh BAL dapat digunakan untuk memperpanjang waktu penyimpanan makanan dan minuman karena dapat menekan pertumbuhan mikroorganisme yang tidak diinginkan sehingga dapat digunakan sebagai bahan pengawet makanan. Peranan bakteri asam laktat yang dapat memproduksi bahan pengawet makanan menjadi perhatian khusus untuk dikembangkan lebih lanjut karena dapat menjadi alternatif pengawet makanan dan mengurangi penggunaan zat pengawet kimia yang sering disalahgunakan. Berdasarkan jalur yang digunakan dalam memfermentasi glukosa, bakteri asam laktat dibagi menjadi dua kelompok, yaitu BAL homofermentatif dan BAL heterofermentatif. Dibandingkan bakteri asam laktat homofermentatif, bakteri asam laktat heterofermentatif menghasilkan senyawa antimiroba yang lebih beragam, yaitu selain menghasilkan asam laktat juga dapat menghasilkan asam asetat/etanol, karbon dioksida, dan bakteriosin. Penelitian ini bertujuan untuk menyeleksi BAL heterofermentatif isolat ASI yang memiliki aktivitas penghambatan tertinggi terhadap bakteri patogen dan menyeleksi BAL heterofermentatif isolat ASI yang berpotensi menghasilkan bakteriosin. Penelitian ini dibagi ke dalam dua tahapan, yaitu : (1) Seleksi awal isolat BAL dengan pengujian aktivitas penghambatan terhadap bakteri patogen (2) Seleksi BAL yang berpotensi menghasilkan bakteriosin. Tahap kedua terbagi menjadi empat bagian, yaitu: (a) Penentuan aktivitas antimikroba dengan metode kontak, (b) Penentuan waktu pertumbuhan BAL, (c) Konfirmasi BAL penghasil bakteriosin, (d) Ekstraksi bakteriosin dan uji penghambatannya terhadap bakteri patogen. Kultur isolat ASI yang digunakan berjumlah 25 isolat, yaitu Lactobacillus heterofermentatif (A10, A17, A21, A33, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R29, dan R33), Leuconostoc (R1, R9, dan R10), dan bakteri asam laktat heterofermentatif isolat ASI lain yang belum diketahui genusnya (A5, A6, A11, A13, A25, A30, A32, A37, dan B2). Kultur bakteri uji yang digunakan adalah Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, dan Salmonella typhimurium. Pada seleksi awal isolat BAL, digunakan metode difusi agar atau sumur. Diantara 25 isolat BAL yang diuji, terdapat 10 isolat yang memiliki penghambatan yang tinggi terhadap Listeria monocytogenes, yaitu isolat A25, A13, A5, A6, A10, R29, R2, A21, R2, dan R33 dengan penghambatan berkisar antara 12.1-14 mm. Kesepuluh isolat tersebut diuji kembali penghambatannya terhadap Listeria monocytogenes dengan metode kontak agar perubahan jumlah Listeria monocytogenes dapat terukur dengan jelas. Diantara 10 isolat BAL tersebut, terdapat 6 isolat yang memiliki penghambatan yang tinggi terhadap Listeria monocytogenes, yaitu isolat A10, R29, R1, R2, A21, dan R33. Pada metode kontak ini, supernatan isolat A10 yang dinetralkan dapat menurunkan jumlah Listeria monocytogenes sebesar 0.03 log cfu/ml, sedangkan pada supernatan 5 isolat yang dinetralkan lainnya (R29, R1, R2, A21, dan R33), jumlah Listeria monocytogenes meningkat dengan peningkatan yang bervariasi, yaitu berkisar antara 0.03-0.6 log cfu/ml. Kenaikan ini masih di bawah kenaikan pada kontrol, dimana kenaikkan Listeria monocytogenes pada kontrol sebesar 1.3 log cfu/ml. Masing-masing BAL membutuhkan waktu inkubasi yang berbeda-beda untuk mencapai akhir fase eksponensial. Isolat A10, A21, dan R1 mencapai akhir fase eksponensial setelah 13 jam inkubasi, isolat R2 setelah 16 jam inkubasi, isolat R29 setelah 21 jam inkubasi, dan isolat R33 setelah 19 jam inkubasi. Pada supernatan isolat A10 dan R2 yang diinkubasi sampai akhir fase eksponensial (A10 13 jam, R2 16 jam) dan dinetralkan, Listeria monocytogenes mengalami kenaikan sebesar 1.1 dan 0.9 log cfu/ml. Kenaikan ini lebih tinggi bila dibandingkan dengan perubahan jumlah Listeria monocytogenes yang dikontakkan dengan isolat A10 dan R2 yang telah diinkubasi selama 24 jam. Hal ini menunjukkan bahwa penghambatan terhadap Listeria monocytogenes oleh supernatan isolat A10 dan R2 yang diinkubasi selama 24 jam lebih baik daripada isolat A10 dan R2 yang diinkubasi sampai akhir fase eksponensial. Oleh karena itu, untuk pengujian tahap selanjutnya dipilih isolat BAL dengan waktu inkubasi 24 jam yang menunjukkan penghambatan terbesar pada metode kontak, yaitu isolat A10 karena paling berpotensi menghasilkan bakteriosin. Pada tahap terakhir dilakukan pengendapan protein dalam supernatan netral dengan penambahan ammonium sulfat ke dalam supernatan isolat A10 agar diperoleh endapan yang diharapkan mengandung bakteriosin. Endapan tersebut setelah diujikan dengan metode sumur tidak menunjukkan penghambatan terhadap kelima bakteri uji (Listeria monocytogenes, Staphilococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella thypimurium dan Escherichia coli). Tidak adanya penghambatan kemungkinan disebabkan metode isolasi bakteriosin yang digunakan belum efektif mengendapkan bakteriosin yang ada. Selain itu, dapat juga disebabkan oleh larutan buffer fosfat yang digunakan terlalu banyak sehingga konsentrasi bakteriosin terlalu rendah untuk dapat menghambat bakteri uji.