Bioprospeksi Lipase Asal Tempe Indonesia: Isolasi, Identifikasi, Kloning, dan Karakterisasi Lipase Novel dari Micrococcus luteus EMP48-D.

Abstract

Tempe merupakan pangan tradisional asli Indonesia yang dibuat melalui proses fermentasi, umumnya menggunakan Rhizopus oligosporus. Selain R. oligosporus, keberadaan bakteri menjadi sangat penting dalam produksi tempe, yang mana beberapa dari mereka berperan dalam meningkatkan kualitas tempe. Penelitian ini dilakukan untuk mengidentifikasi dan memeriksa hubungan antara bakteri lipolitik yang berasosiasi dengan tempe CMG, EMP dan RTI serta peran mereka dalam pelepasan senyawa asam lemak bebas. Bakteri lipolitik yang ditemukan di setiap sampel tempe memiliki kepadatan sekitar 0.1% dari jumlah total populasi bakteri. Tempe CMG merupakan tempe dengan jumlah populasi bakteri lipolitik tertinggi sebesar 1.04 × 106 cfu g-1 diikuti oleh tempe EMP sebesar 2.88 × 105 cfu g-1, dan tempe RTI sebesar 1.72 × 104 cfu g-1. Profil asam lemak bebas menunjukkan bahwa aktivitas lipolisis terjadi selama fermentasi tempe. Tempe EMP menunjukkan pembebasan pada semua jenis asam lemak bebas dominan pada tempe, sementara tempe CMG lebih aktif dalam membebaskan asam γ-linolenat dan asam stearat dan RTI hanya secara aktif melepaskan asam linolenat. Karakterisasi awal menggunakan gen parsial sekuen 16S rRNA, dari ± 200 isolat lipolitik yang diperoleh menunjukkan sebagian besar isolat yang diidentifikasi tergolong dalam tiga filum dominan. Filum Proteobacteria terbagi menjadi sembilan genus: Serratia, Klebsiella, Citrobacter, Proteus, Morganella, Raoultella, Pseudomonas, Moraxella, dan Acinetobacter; filum Firmicutes terbagi menjadi dua genus: Bacillus dan Staphylococcus; Sementara filum Actinobacteria terbagi menjadi empat genus; Micrococcus, Salinibacterium, Kocuria, dan Barrientosiimonas; Beberapa isolat juga diklasifikasikan sebagai klon yang belum terkulturkan. Lipase bakteri adalah kelompok penting dari enzim yang menawarkan potensi besar dalam sintesis organik, sehingga terdapat minat yang cukup besar dalam upaya mengidentifikasi dan mengembangkan lipase-lipase bakteri jenis baru. Bakteri penghasil lipase (EMP48-D) diisolasi dari sampel tempe. Gen yang mengkodekan lipase dari EMP48 ditransformasikan ke dalam inang Escherichia coli BL21 menggunakan teknik PCR kloning. Prediksi urutan asam amino dari urutan nukleotida (1,356 pb) mengkodekan protein yang terdiri atas 451 residu asam amino dengan berat molekul sekitar 30 kDa berdasarkan hasil deteksi zimogram. Protein yang dideduksi menunjukkan 98% identitas urutan asam amino terhadap lipase dari Micrococcus luteus trpE16. Analisis sekuen juga menunjukkan bahwa protein mengandung G-Y-S-Q-G yang merupakan karakteristik khas dari lipase. Kehadiran sinyal peptida sepanjang 31 residu menunjukkan protein dimungkinkan untuk sekresi ekstraseluler. Struktur 3D yang diprediksi dari lipase EMP48-D menunjukkan topologi membentuk lipatan α/β-hidrolase yang terdiri atas sembilan β-strand dan 12 α-heliks. Ser244, His420 dan Asp388 berperan iii sebagai residu triad katalitik. Residu serin katalitik (Ser244) terletak pada siku nukleofilik antara strand β6 dan helix α4 dalam struktur inti. Lipase EMP48-D menunjukkan variabel spesifisitas/aktivitas hidrolitik yang berbeda terhadap berbagai ester p-nitrophenyl. p-nitrophenyl caprylate (C8) dan p-nitrophenyl laurate (C12) merupakan ester yang paling efisien dihidrolisis dibandingkan dengan jenis ester lainnya. Lipase EMP48-D menunjukkan aktivitas spesifik optimum pada pH 5.0 dan suhu 40 °C sebesar 15.02 ± 2.33 U mg-1. Stabilitas enzim berada pada kisaran pH 4.0 – 5.0 dan dapat mempertahankan 42.13% dari aktivitasnya sekalipun di inkubasi pada suhu 65 °C selama 180 menit. Di antara pelarut organik yang diujikan, 2-propanol aktivitas lipase relatif tampak stabil pada 113.5%, diikuti oleh butanol dengan peningkatan aktivitas relatif sebesar 113%, etanol sebesar 105.2%, asetonitril sebesar 103,7% dan metanol sebesar 102%, sementara pelarut organik seperti n-heptana, dan n-heksana menunjukkan penghambatan aktivitas lipase hingga tersisa masing-masing 10.7%, dan 9.6%. Ion Mg2+ (113.5%), Ca2+ (111.5%), dan Fe2+ (160.4%) diketahui mampu meningkatkan aktivitas relatif enzim sementara ion Na+ (90.8%), K+ (91.5%), dan Zn2+ (0.5%) menghambat aktivitas relatif enzim. Aktivitas enzim terpengaruh secara tidak signifikan dengan keberadaan pengelat logam EDTA yang menunjukkan bahwa lipase EMP48-D bukan metalloenzyme. Aktivitas lipase sangat terhambat ketika enzim diinkubasi menggunakan Triton X-100 (39,3%), Tween 80 (31.6%), Tween 20 (7.2%), dan sodium dodesil sulfat (7.9%). Demonstrasi transesterifikasi lipase EMP48-D menunjukkan terjadinya konversi asam lemak bebas menjadi asam lemak metil ester hingga 77.25 ± 0.5% dalam pelarut metanol.