Gen Alkenal Reduktase Asal Padi (Oryza sativa L.): Isolasi dan Karakterisasi Ekspresi serta Analisis Fungsi Promoter Spesifik Akar

Abstract

Pemilihan gen target yang akan diinsersikan ke dalam genom tanaman dalam kegiatan rekayasa genetika tanaman merupakan salah satu hal yang penting dalam menentukan keberhasilan perbaikan sifat yang diinginkan. Gen target yang dikendalikan oleh promoter spesifik jaringan atau organ dalam kegiatan rekayasa genetika tanaman sangat diperlukan, untuk menghindari terjadinya fenotipe yang tidak diinginkan pada tanaman transgenik yang dihasilkan. Promoter adalah suatu bagian dari gen yang sangat penting dalam pengaturan ekspresi suatu gen. Promoter spesifik akar penting dalam pengaturan ekspresi dari gen-gen yang terkait dengan respon terhadap cekaman abiotik dan penyerapan nutrisi. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi gen dan promoter gen OsAER1. Bagian tiga dari disertasi ini menjelaskan tentang isolasi dan karakterisasi gen OsAER1 pada tanaman padi. Sekuen genomik gen OsAER1 (Oryza sativa 2- alkenal reduktase-1) diamplifikasi dari 4 kultivar padi, yaitu Awan Kuning, IR64, Way Rarem, dan IR20, kemudian dan disekuensing. Analisis prediksi gen menunjukkan bahwa gen OsAER1 terdiri dari 3 ekson dan 2 intron, dengan ukuran CDS utuh sebesar 1.080 bp. Analisis filogenetik menunjukkan bahwa sekuen CDS utuh OsAER1 dari 4 kultivar padi sangat mirip dengan lokus XM_015760039.1 yang ada di GenBank dari tanaman Oryza sativa grup Japonica. Lokus tersebut diprediksi menyandikan NADP-dependent alkenal double bond reductase P1 (alkenal reductase). Gen alkenal reduktase telah diketahui berfungsi sebagai gen antioksidan yang dapat mendetoksifikasi senyawa reaktif karbonil yang disebabkan oleh cekaman oksidatif. Bagian empat dari disertasi ini menjelaskan tentang isolasi dan karakterisasi promoter OsAER1 yang berasal dari padi. Analisis ekspresi gen OsAER1 pada organ akar, batang dan daun dari 4 kultivar padi (Awan Kuning, IR64, Way Rarem, dan IR20) dilakukan dengan menggunakan metode qRT-PCR. Analisis ekspresi menunjukkan bahwa gen OsAER1 diekspresikan sangat kuat di akar, tetapi hanya diekspresikan lemah di batang dan daun padi kultivar Awan Kuning dan IR64. Fragmen dengan ukuran 3.082 bp dari start kodon ATG ke arah hulu dari gen OsAER1 diamplifikasi dan diinsersikan ke dalam vektor kloning, dan disekuensing. Analisis sekuen promoter OsAER1 dengan ukuran 3.082 bp menunjukkan bahwa terdapat 119 motif cis acting element yang ada pada promoter yang terlibat dalam pengendalian pertumbuhan dan perkembangan tanaman atau dalam proses fisiologi tanaman, khususnya dalam pertahanan tanaman terhadap cekaman abiotik. Fragmen promoter OsAER1 yang berukuran 3.082 bp disambungkan dengan gen GUS pada vektor biner pCAMBIA1300int- GUS-tNOS, dan ditransformasikan ke dalam tanaman padi dan tembakau. Analisis ekspresi GUS di tanaman padi dilakukan dari fase kecambah sampai fase generatif, sedangkan untuk tanaman tembakau dilakukan pada fase kecambah umur 3, 10, dan 20 hari setelah semai. Analisis aktivitas promoter OsAER1 menunjukkan bahwa promoter tersebut mengendalikan ekspresi gen secara dominan dan terus menerus di akar tanaman padi dari fase kecambah sampai fase generatif. Analisis histokimia pada penampang melintang tanaman padi transgenik menunjukkan bahwa promoter OsAER1 mengarahkan ekspresi gen GUS di hampir diseluruh organ akar, yaitu pada jaringan epidermis, korteks, endodermis dan berkas pengangkut. Pola ekspresi yang berbeda diamati di tanaman tembakau transgenik, di mana ekspresi GUS diamati di bagian berkas pengangkut daun. Perbedaan pola ekspresi GUS di tanaman padi dan tembakau transgenik menunjukkan adanya faktor endogen terhadap aktivitas promoter di tanaman transgenik. Analisis ekspresi GUS juga dilakukan setelah tanaman diinduksi dengan NaCl, AlCl3, zat pengatur tumbuh (ABA dan IAA), serta perlakuan rendaman. Ekspresi GUS meningkat di bagian ujung akar dan meristem akar padi transgenik yang diberi perlakuan NaCl dan AlCl3 dibandingkan dengan tanaman transgenik yang tidak diberi perlakuan. Ekspresi GUS juga meningkat pada tanaman yang diinduksi oleh adanya ABA, IAA dan rendaman. Hasil tersebut didukung dengan adanya motif cis acting element yang dilibatkan dalam cekaman abiotik di dalam sekuen promoter gen OsAER1, seperti W-Box (TGAC), MYB (YAACKG), MYC (CANNTG), ABRE (YACGTGKC), ARF( TGTCTC), DRE (RCCGAC), RAV (CAACA), LTRE (CCGAC), dan GCC-Box (GCCGCC). Pada bagian lima disertasi ini menjelaskan analisis fungsi promoter gen OsAER1 pada tanaman tembakau. Kegiatan ini diawali dengan pembuatan seri delesi promoter (mutan promoter) dengan ukuran -2.094 bp (PA4), -1.562 bp (PA3), -1.026 bp (PA2), dan -549 bp (PA1) dari start kodon (ATG). Mutan promoter kemudian dirakit dalam konstruk vektor biner pCAMBIA1300int-GUStNOS. Konstruk mutan promoter digunakan untuk transformasi transien yang dapat memprediksi aktivitas suatu promoter dalam kecambah utuh tembakau 5 hari setelah perkecambahan. Uji GUS menunjukkan bahwa promoter OsAER1 mengarahkan ekspresi gen di bagian akar, hipokotil, dan kotiledon, tetapi tidak di helaian daun. Rangkaian konstruk mutan promoter kemudian ditransfomasi secara stabil ke tanaman tembakau. Ekspresi gen GUS ditemukan di akar, hipokotil, kotiledon, dan petiole dari kecambah umur 10 dan 20 hari setelah perkecambahan. Pada bagian ke enam disertasi ini dijelaskan tentang analisis fungsi promoter OsAER1 pada tanaman padi transgenik. Konstruk 4 mutan promoter (PA1, PA2, PA3, dan PA4) digunakan untuk transformasi stabil tanaman padi kultivar Nipponbare. Uji GUS menunjukkan bahwa ke empat mutan promoter mengendalikan ekspresi gen GUS secara konstan di akar padi dari fase kecambah sampai fase generatif. Selain itu, aktivitas GUS juga dideteksi pada anther dan lapisan aleuron benih padi umur 7, 12, 20 hari setelah anthesis. Kebocoran ekspresi GUS di culm selama fase pengisian benih terdeteksi pada tanaman transgenik yang ditransformasi dengan promoter mutan PA3, tetapi kebocoran ini tidak terdeteksi pada tanaman transgenik yang ditransformasi dengan promoter mutan PA4. Hal ini menunjukkan bahwa mutan promoter OsAER1 PA4 merupakan minimal promoter spesifik akar yang menekan ekspresi gen di bagian culm pada fase pengisian benih. Mutan promoter PA1 mengendalikan ekspresi GUS hampir disemua bagian organ tanaman, sehingga berfungsi sebagai promoter konstitutif. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa promoter OsAER1 dapat dimanfaatkan untuk pengendali ekspresi gen target secara terus menerus di organ akar