Embriogenesis Somatik dan Transformasi Genetik Tebu (Saccharum officinarum L.) Kultivar PS 864 dengan Gen MmCuZn-SOD untuk Peningkatan Toleransi Terhadap Lahan Masam.

Abstract

Salah satu komoditas perkebunan penting yang dikembangkan secara nasional adalah tanaman tebu. Rendahnya produksi tebu nasional antara lain disebabkan karena area perkebunan tebu di lahan subur mengalami penurunan, sehingga untuk menaikkan produksi tebu, perluasan area tanam diarahkan ke lahan suboptimal. Sebagian besar lahan suboptimal Indonesia merupakan podsolik merah kuning yang pH-nya rendah dan konsentrasi aluminiumnya mencapai tingkat toksisitas tinggi. Namun sampai saat ini belum ada varietas (genotipe) tebu yang adaptif pada lahan masam. Oleh karena itu, usaha untuk mendapatkan genotipe tanaman tebu yang toleran terhadap kondisi cekaman lingkungan masam sangat penting dilakukan. Cekaman abiotik tersebut menimbulkan Reactive Oxygen Spesies (ROS) yang sangat beracun bagi sel tanaman. Superoksida dismutase (SOD) mempunyai kemampuan untuk mereduksi cekaman ROS. Salah satu cara untuk merakit varietas tersebut adalah melalui rekayasa genetika untuk mendapatkan tanaman transgenik yang toleran terhadap cekaman pH rendah dan Al dengan menggunakan gen SOD. Keberhasilan mendapatkan tanaman transgenik ditentukan dari ketepatan pemilihan bahan tanaman untuk transformasi genetik. Kalus embriogenik digunakan sebagai eksplan dalam transformasi genetik untuk mendapatkan efisiensi transformasi yang tinggi dan menghindari terjadinya khimera. Permasalahan utama dalam proses rekayasa genetika tanaman tebu adalah belum adanya metode regenerasi embriogenesis somatik tebu yang menjamin keberhasilan hidup dan tumbuh pasca transformasi dan belum adanya protokol standar untuk transformasi genetik tebu menggunakan vektor Agrobacterium tumefaciens. Tindakan penyimpanan in vitro terhadap galur-galur transgenik yang diperoleh sangat diperlukan untuk penyediaan materi pemuliaan tebu baik untuk kegiatan seleksi maupun sebagai sumber keragaman baru. Tujuan umum penelitian ini adalah untuk mendapatkan kalus embriogenik dan struktur embrio somatik, tanaman tebu transgenik yang toleran lahan masam dan metode penyimpanan in vitro biakan tebu transgenik melalui enkapsulasi. Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah tanaman tebu PS 864. Eksplan yang digunakan untuk induksi kalus embriogenik adalah daun muda yang masih menggulung pada bagian ujung batang. Media yang digunakan untuk induksi kalus embriogenik adalah media dasar MS yang diperkaya dengan 2,4-D (1, 3, dan 5 mg/L) dan BAP (0 dan 5 mg/L), kemudian dilakukan optimasi dengan penambahan glutamina dan kasein hidrolisat. Pendewasaan kalus nodularss dilakukan dengan penambahan BAP (0 dan 5 mg/L) dan kinetin (0, 1, 3, dan 5 mg/L), sedangkan perkecambahan embrio somatik dilakukan dengan menggunakan MS penuh (100%) dan ½ MS (50%) ditambah 20 g/L sukrosa, asam amino dan atau zat pengatur tumbuh. Kegiatan transformasi genetik dilakukan terhadap kalus nodular menggunakan gen MmCuZn-SOD dengan perantara Agrobacterium tumefaciens. Tanaman transgenik yang diperoleh kemudian disimpan secara in vitro dengan teknik enkapsulasi menggunakan paklobutrazol pada konsentrasi 0, 1, 2, dan 3 mg/L atau manitol pada konsentrasi 0, 1, 3, dan 5%. Proses yang mempengaruhi embriogenesis somatik pada tanaman tebu bersifat spesifik untuk setiap genotipe sehingga penentuan kombinasi media induksi kalus embriogenik terbaik pada klon tebu sangat diperlukan. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa media induksi kalus embriogenik tanaman tebu terbaik adalah media MS yang mengandung 3 mg/L 2,4-D yang diperkaya dengan 100 mg/L glutamina dan 500 mg/L kasein hidrolisat. Media ini menghasilkan persentase pembentukan kalus embriogenik sebesar 96.3% dan menghasilkan kalus tipe A yaitu kalus nodular, berwarna agak putih kekuningan, dan basah. Tipe kalus tersebut sangat potensial untuk membentuk embrio somatik. Pada media pendewasaan, perkembangan embrio somatik tanaman tebu diawali dengan terbentuknya embrio globular pada umur 5 minggu setelah dikulturkan. Embrio skutelar terbentuk pada minggu ke-7, kemudian terbentuk embrio koleoptilar setelah 12 minggu dalam media kultur. Rerata jumlah embrio globular tertinggi (38 buah) dihasilkan dari media MS ditambah 5 mg/L BAP yang dikombinasi dengan 1 atau 3 mg/L kinetin. Jumlah embrio skutelar dan koleoptilar tertinggi dihasilkan dari perlakuan 3 mg/L kinetin yaitu sebanyak 21 dan 19. Media MS penuh ditambah 2 mg/L kinetin dan 100 mg/L glutamina adalah media perkecambahan yang menghasilkan persentase jumlah embrio somatik tumbuh menjadi struktur bipolar tertinggi (73.29%) dengan jumlah daun terbanyak (4.58). Analisis histologi menunjukkan bahwa embrio somatik tebu berasal dari banyak sel melalui proses budding dan juga berasal dari satu sel tunggal. Hasil penelitian transformasi genetik pada kalus nodular tebu dengan gen MmCuZn-SOD yang diperantarai A. tumefaciens menghasilkan efisiensi transformasi tertinggi yaitu 33.3%. Hasil ini diperoleh dari perlakuan konsentrasi A. tumefaciens pada OD600 0.2, waktu inkubasi 10 menit dalam suspensi bakteri, dan ko-kultivasi selama 3 hari. Analisis PCR terhadap 16 transforman putatif menunjukkan bahwa 10 planlet positif mengandung gen MmCuZn-SOD. Evaluasi toleransi tanaman transgenik dan non transgenik dilakukan dengan menggunakan media seleksi in vitro yang mengandung 500 mg/L Al dan tanah masam (pH 4.3). Hasilnya menunjukkan bahwa tanaman transgenik secara signifikan memiliki toleransi terhadap Al dan tanah masam yang lebih tinggi dibandingkan dengan tanaman non transgenik. Biakan transgenik yang dihasilkan selanjutnya disimpan secara in vitro dengan teknik enkapsulasi, menggunakan 3% Na-alginat, dengan penambahan paklobutazol atau manitol. Penggunaan paklobutrazol terbukti lebih efektif menekan pertumbuhan eksplan tebu dari pada manitol. Penyimpanan dengan penambahan 3 mg/L paklobutrazol adalah perlakuan penyimpanan terbaik untuk biakan tebu dengan teknik enkapsulasi dengan masa penyimpanan mencapai tujuh bulan. Perlakuan ini juga mampu membentuk tunas berwarna hijau mencapai 50% dan memiliki daya pemulihan serta regenerasi pasca penyimpanan hingga mencapai 75%. Proses pemulihan pasca penyimpanan dengan paklobutrazol memperlihatkan penampakan biakan yang lebih tegar dan lebih hijau dari pada perlakuan manitol.