Isolasi, Kloning, dan Ekspresi Gen dpe dari Agrobacterium tumefasiens sebagai Gen Penyandi Enzim D-Psicose 3-Epimerase (DPEase).

Abstract

Gula langka atau yang disebut sebagai rare sugar, contohnya D-psikosa, merupakan gula yang jumlahnya sangat terbatas di alam. D-psikosa memiliki manfaat dibidang farmasi yaitu untuk menyembuhkan diabetes tipe2. Untuk itu, D-psikosa memiliki potensi untuk dikembangkan di Indonesia dalam upaya pengentasan diabetes tipe2. Terbatasnya jumlah D-psikosa menjadi faktor pembatas dalam pemanfaatannya. Oleh karena itu, dibutuhkan upaya dalam pengembangan produk D-psikosa. D-psikosa dapat diperoleh secara enzimatik dengan menggunakan Dpsikosa 3-epimerase (DPEase), yang berfungsi mengubah D-fruktosa menjadi Dpsikosa. Studi literasi menunjukkan bahwa enzim DPEase yang disandikan oleh gen dpe dari Agrobacterium tumefaciens memiliki daya konfersi tertinggi untuk spesifik produk D-psikosa, sehingga enzim DPEase memiliki karakter yang sesuai untuk diproduksi di Indonesia, sebagai upaya dalam mendukung pengembangan D-psikosa. Penelitian ini bertujuan untuk memproduksi enzim DPEase rekombinan dengan cara kloning dan ekspresi gen dpe dari A. tumefaciens asal Indonesia. Tahapan penelitian dimulai dari amplifikasi gen dpe dengan teknik Polymerase chain rection (PCR), dilanjutkan dengan ligasi ke dalam vektor pGEM®-T Easy dan transformasi ke Escherichia coli DH5α. Koloni positif dikonfirmasi dengan teknik PCR, pemotongan plasmid dengan enzim restriksi dan sekuensing. Gen dpe kemudian disubklon ke plasmid pET 21b dan ditransformasi ke bakteri E. coli BL21 (DE3) untuk proses ekspresi gen. Ekspresi gen dilakukan dengan induksi 1 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) dan dianalisis dengan SDS-PAGE. Produk PCR gen dpe berukuran 870 bp telah berhasil diperoleh. Hasil analisa sekuen asam amino dari gen dpe yang diperoleh memiliki tingkat identities sebesar 96,6% dan similarities sebesar 97,9% dengan asam amino penyusun enzim DPEase dari A. tumefaciens yang telah dilaporkan. Hasil analisis kesejajaran meggunakan perangkat lunak bioedit, menunjukkan adanya delapan perbedaan asam amino yang berada pada posisi basa ke Val50 (valine), Qly53 (Glysin), Thr94 (Therionine), His134 (Histidin), Leu194 (Leusin), Glu196 (Glutamic acid), Val242 (Valin), dan Leu269 (Leucine). Gen dpe telah berhasil di ekspresikan dan menghasilkan enzim DPEase rekombinan yang berukuran 32 kDa.