Keragaman Bakteri Kitinolitik Asal Hutan Tropis dan Perkebunan Kelapa Sawit Jambi dan Potensi Enzim Pendegradasi Kitin Ganoderma boninense

Abstract

Keragaman bakteri kitinolitik dapat dipelajari melalui metode kultur dan nonkultur. Metode nonkultur yang menggunakan teknik molekuler atau metagenomik, mampu memberikan informasi yang lebih lengkap mengenai keragaman bakteri tanah tanpa harus menumbuhkan sel terlebih dahulu. Metagenomik menjadi pilihan untuk pendeskripsi keragaman mikrob dalam wilayah yang spesifik termasuk area hutan dan perkebunan. Salah satu teknik analisis keragaman komunitas bakteri ialah dengan metode DGGE (Denaturing Gel Gradient Electrophoresis). Pendekatan dengan metode kulturasi bakteri asal hutan dapat digunakan untuk mencari bakteri galur unggul dalam memproduksi enzim kitinolitik yang spesifik dan unik. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keragaman bakteri kitinolitik melalui metode kultur dan non kultur dari Taman Nasional Bukit Dua Belas (TNBD) dan perkebunan kelapa sawit, memurnikan secara parsial dan melakukan karakterisasi kitinase ekstraseluler dari isolat potensial dan menguji potensinya sebagai agens biokontrol cendawan Ganoderma boninense. Komposisi komunitas bakteri tanah yang terdapat pada dua sistem tanah yang berbeda dari hutan tropis TB dan daerah perkebunan kelapa sawit SW diuji dan dibandingkan dengan menggunakan metode DGGE untuk menganalisis sekuen gen 16S rRNA dan gen ChiA. Sekuen gen 16S rRNA dan ChiA dipengaruhi oleh komposisi kimia sampel dari dua tipe tanah yang berbeda seperti pH tanah, karbon total (TC), nitrogen total (TN), ketersediaan fosfat (AP), dan rasio C/N. Kandungan bahan-bahan organik pada perkebunan kelapa sawit cenderung lebih tinggi jika dibandingkan dengan kandungan bahan organik pada Taman Nasional Bukit Dua Belas. Secara umum penggunaan DGGE dapat memisahkan banyak pita DNA gen 16S rRNA dan ChiA. Masing-masing pita yang terpisah menunjukkan perbedaan spesies bakteri tanah. Analisis DGGE gen 16S rRNA dan ChiA pada 4 sampel tanah menghasilkan pita DGGE yang cukup beragam. Analisis indeks keragaman Shannon-Wienner (H’) digunakan untuk mengestimasi keragaman mikrob pada tiap lokasi. Indeks keragaman (H’) berdasarkan gen 16S rRNA pada empat lokasi berkisar dari 1.90-3.04 dan untuk gen ChiA berkisar antara 1.094- 1.705. Indeks kemerataan (e’) dari gen 16S rRNA berkisar antara 0.914-0.939 dn untuk gen ChiA berkisar antara 0.611-0.740. Isolasi bakteri kitinolitik pada media agar-agar kitin dari Taman Nasional Bukit Dua Belas dan perkebunan kelapa sawit di Provinsi Jambi menghasilkan 63 isolat bakteri kitinolitik dan hanya 10 isolat yang berpotensi menghambat pertumbuhan hifa Ganoderma boninense setelah diuji antagonis dan tidak menimbulkan respon hipersensitif / hypersensitive Response (HR) terhadap tanaman tembakau. Indeks kitinolitik yang dihasilkan dari 10 isolat kitinolitik berkisar antara 0.2 sampai 4, sedangkan aktivitas spesifik kitinase berkisar antara 4.27-6.30 Umg-1 protein. Analisis sekuen gen penyandi 16S rRNA menunjukkan bahwa 7 isolat kitinolitik memiliki kedekatan dengan kelompok Bacillus dan 3 isolat lainnya memiliki kedekatan dengan kelompok Pseudomonas. Isolat B. cereus TB04-05 dipilih untuk dikarakterisasi dan diuji kemampuan enzimnya terhadap pertumbuhan hifa G. boninense secara In vitro berdasarkan indeks kitinolitik dan aktivitas spesifik tertinggi yang dihasilkan isolat ini. Isolat B. cereus TB04-05 memiliki pertumbuhan yang meningkat mulai dari jam ke 0-12 jam inkubasi dan kemudian pertumbuhan relatif stabil sampai mencapai jam ke-42 inkubasi kemudian menurun setelah jam ke-48 inkubasi. Kitinase diproduksi dan relatif meningkat sampai jam ke-9 inkubasi dan setelah jam ke 48 inkubasi aktivitas menurun secara drastis. Pengendapan protein dengan menggunakan amonium sulfat menunjukkan konsentrasi garam ammonium sulfat 50% mampu menghasilkan aktivitas spesifik maksimum sebesar 8.420 Umg-1 protein. Hasil analisis SDS-PAGE dari endapan protein menunjukkan adanya dua pita dari fraksi protein B. cereus TB04-05 hasil pengendapan 50% amonium sulfat dengan estimasi bobot molekul sekitar 70 kDA dan 37 kDa. Aktivitas kitinase enzim ekstrak kasar dan hasil pengendapan 50% amonium sulfat dari isolat B. cereus TB04-05 pada pH optimum menunjukkan aktivitas kitinase maksimum pada pH 7.0 dengan nilai aktivitas kitinase sebesar 5.34 U mg-1 protein dan 6.12 U mg-1 protein. Enzim ekstrak kasar memiliki aktivitas optimum pada suhu 30 oC sebesar 5.62 U mg-1 protein, sedangkan enzim hasil pengendapan memiliki aktivitas maksimum pada suhu 40 oC, sebesar 6.15 U mg-1 protein. Kedua enzim tersebut stabil pada pH dan suhu optimum selama 180 menit inkubasi. Uji penghambatan cendawan patogen G. boninense secara in vitro menggunakan kultur sel 9 jam, enzim ekstrak kasar dan enzim hasil pengendapan 50% amonium sulfat diamati di media agar-agar menggunakan metode difusi sumur. Enzim hasil pengendapan 50% amonium sulfat mampu menghambat pertumbuhan G. boninense lebih baik dibandingkan enzim ekstrak kasar dan kultur sel 9 jam yaitu sebesar 51.15%, 48.14% dan 17.83% pada hari ke-6 setelah pengujian. Ada perbedaan mekanisme antagonis antar perlakuan yang digunakan, pengamatan hifa dengan pengujian kultur isolat menyebabkan hifa menggulung pada G. boninense, enzim ekstrak kasar menyebabkan hifa bercabang sedangkan enzim hasil pengendapan 50% amonium sulfat menyebabkan hifa lisis dan penipisan dinding hifa.