| dc.description.abstract | Proteksi tanaman modern sangat bergantung pada penggunaan bahan kimia untuk mengatasi hama dan penyakit. Akan tetapi, meningkatnya perhatian terhadap kesehatan dan kerusakan lingkungan yang disebabkan oleh penggunaan bahan kimia untuk pertanian menyebabkan peningkatan tuntutan yang lebih besar terhadap pertanian yang berkelanjutan. Pada tanah yang menekan penyakit dan kompos, penekanan penyakit diperoleh tanpa penggunaan bahan kimia. Penekanan penyakit selalu berhubungan dengan keberadaan bakteri antagonis yang jumlahnya semakin meningkat di dalam tanah. Bakteri rizosfer antagonis yang bermanfaat ini dapat dikembangkan sebagai agen pengendali biologi untuk mengurangi penggunaan bahan kimia di bidang pertanian. Di Indonesia, bakteri antagonis asli rizosfer tanaman kedelai belum banyak dilaporkan dan potensinya sebagai agen biokontrol perlu diteliti lebih lanjut. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan kandidat agen biokontrol terhadap cendawan patogen tular tanah Sclerotium rolfsii, Fusarium oxysporum atau Rhizoctonia solani untuk tanaman kedelai. Delapan puluh satu isolat bakteri rizosfer tanaman kedelai digunakan dalam penelitian ini. Cendawan patogen tular tanah S. rolfsii, F. oxysporum diperoleh dari Departemen Proteksi Tanaman, IPB. dan R. solani diperoleh dari Balai Penelitian Tanah Bogor. Bakteri Pseudomonas chlororaphis DF190 dan DF202 (Prof. Dr. Dilantha Fernando, University of Manitoba, Kanada); Pseudomonas aureofaciens 30-84, Pseudomonas fluorescens Q2-87, Q8-R1 dan Pseudomonas fluorescens Pf-5 (Dr. Linda Thomashow, Agricultural Research Service - United States Department of Agriculture (ARS-USDA), Washington State University, Amerika Serikat) disertakan dalam penelitian ini sebagai bakteri kontrol positif deteksi gen-gen anticendawan. Uji antagonisme dilakukan dengan menggunakan metode kultur ganda. Besarnya persentase penghambatan pertumbuhan radial cendawan oleh bakteri dihitung menggunakan rumus 1-(a/b) x 100%, dengan a menunjukkan jarak antara titik pusat cendawan ke arah isolat bakteri, b menunjukkan jarak antara titik pusat cendawan ke sisi yang berlawanan tanpa bakteri. Produksi siderofor oleh isolat-isolat dideteksi dengan menggunakan media agar-agar Chrome Azurol S (CAS). Produksi kitinase ditentukan dengan menggunakan medium sintetik yang mengandung koloid kitin. Produksi hidrogen sianida diketahui dengan menggunakan indikator alkali pikrat.
Keragaman genetik berdasarkan amplified rDNA restriction analysis (ARDRA) dilakukan dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan primer hulu 63f dan primer hilir 1387r. Primer ini mengamplifikasi sekitar 1.300 bp konsensus gen 16S rRNA yang bersifat umum untuk domain bakteri. Produk amplifikasi 16S rDNA yang telah dipurifikasi dipotong dengan enzim restriksi endonuklease HaeIII, RsaI dan AluI (Fermentas Life Science, Uni
Eropa). Pemotongan oleh enzim restriksi dilakukan pada suhu 37ºC semalam. Dendrogram filogenetik dibuat dengan menggunakan metode neighbour-joining dalam software TREECON for Windows 1.3b. Identifikasi molekuler dan analisis keragaman genetik berdasarkan sekuen gen 16S rRNA dilakukan dengan pencarian kemiripan sekuen menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool for Nucleotide (BLASTN) yang terdapat di National Center for Biotechnology Information (NCBI), http://www.ncbi.nlm.gov/BLAST. Untuk pembuatan pohon filogenetik, sekuen gen 16S rRNA disejajarkan dengan menggunakan clustalW, dan dianalisis berdasarkan metode neighbour-joining menurut Jukes dan Cantor dalam program MEGA versi 4. Deteksi gen yang mengkode sintesis senyawa anticendawan dilakukan dengan metode PCR. Tujuh pasang primer digunakan untuk mengamplifikasi gen diacetylphloroglucinol (DAPG), fenazin, pioluteorin dan pirolnitrin. Amplifikasi dengan PCR (Veriti Thermal Cycler, Applied Biosystems, Amerika Serikat) dilakukan dalam 25μl campuran reaksi. Selanjutnya, produk amplifikasi dielektroforesis dengan gel agarosa 1% dalam 1x bufer Tris Boric acid EDTA (TBE) selama 30 menit 100 V, diwarnai dengan ethidium bromida, dan difoto di atas ultraviolet transilluminator. Kloning gen penyandi senyawa anticendawan dilakukan dengan vektor pCR®4Blunt-TOPO (Invitrogen, Jepang) dan pGEM-T Easy (Promega, Amerika Serikat) menggunakan sel elektro-kompeten Escherichia coli TOP 10 dan E. coli EPI 300 sebagai sel inang. Sekuensing dikerjakan dengan ABI 3130 DNA Analyzer (Applied Biosystems, Amerika Serikat). Analisis bioinformasi pencarian kesamaan sekuen nukleotida dilakukan dengan program BLASTN dan protein dengan program BLASTX pada situs NCBI. Perlakuan benih (seed coating) dilakukan dengan melapisi benih dengan bakteri yang telah disuspensikan ke dalam 0.5% karboksil metilselulosa dengan konsentrasi bakteri 107-108 sel/ml. Duapuluh empat benih kedelai yang telah dilapisi dengan masing-masing bakteri ditanam pada tanah yang telah diinfestasi cendawan patogen (103 cfu/g tanah). Penekanan penyakit dievaluasi setelah satu minggu kecambah muncul dengan menghitung jumlah tanaman yang sehat dan tanaman yang menunjukkan gejala karena serangan cendawan patogen pada kondisi tanah steril dan tanah non steril. Analisis kemampuan kolonisasi rizosfer dilakukan dengan penandaan resisten antibiotik rifampisin (Rifr). Perlakuan benih dilakukan dengan cara merendam biji kedelai dalam suspensi bakteri Pseudomonas sp. CRB-Rifr selama 1 jam. Jumlah awal bakteri adalah 106 sel/benih berdasarkan penghitungan bakteri menggunakan standard plate count. Pemantauan perkembangan populasi Pseudomonas sp. CRB-Rifr di rizosfer tanaman kedelai pada tanah steril dan non steril dilakukan selama 6 minggu. Penghitungan jumlah bakteri dilakukan dengan metode cawan sebar pada medium agar-agar King’s B yang mengandung rifampisin 100 μg/ml. Sebelas isolat dari delapan puluh satu isolat Pseudomonas sp. CRB yang diisolasi dari rizosfer tanaman kedelai telah diseleksi mempunyai sifat-sifat yang dapat berperan sebagai biokontrol. Sifat-sifat biokontrol yang dipunyai adalah menunjukkan penghambatan pertumbuhan radial cendawan patogen akar R. solani, S. rolfsii atau F. oxysporum in vitro antara 11.1-60%. Di antaranya, 7 isolat menghasilkan siderofor, 2 isolat menghasilkan kitinase dan 4 isolat menghasilkan hidrogen sianida.
Pemotongan 16S rDNA dengan tiga enzim restriksi HaeIII, RsaI dan AluI menghasilkan 3 sampai 5 pita dengan ukuran yang berbeda untuk masing-masing perlakuan enzim restriksi. Perbedaan pola potongan pita DNA tersebut telah dapat membedakan isolat satu dengan isolat yang lain. Dendrogram berdasarkan ARDRA mengungkapkan tingkat keragaman genetik yang cukup tinggi di antara isolat-isolat Pseudomonas sp. CRB, karena berdasarkan analisis ini tujuh kelompok ribotipe dapat ditunjukkan. Identifikasi molekuler berdasarkan sekuen gen 16S rRNA (600 nukleotida) bakteri antagonis Pseudomonas sp. CRB mengarah ke spesies yang berbeda dengan identifikasi berdasarkan morfologi dan fisiologis Microgen™ tetapi masih pada genus yang sama yaitu Pseudomonas. Isolat-isolat Pseudomonas sp. CRB mempunyai kemiripan yang tinggi antara 83-100% terhadap berbagai spesies dalam genus Pseudomonas. Tingkat kemiripan terhadap berbagai spesies Pseudomonas yang beragam juga menunjukan keragaman spesiesnya. Pohon filogenetik membentuk empat kelompok hubungan kekerabatan. Isolat-isolat yang berada dalam kelompok yang sama mempunyai hubungan kekerabatan yang dekat. Enam pasang primer yang digunakan berhasil mengamplifikasi gen target penyandi senyawa anticendawan pada bakteri kontrol positif. Empat pasang primer menghasilkan pita tidak spesifik pada Pseudomonas sp. CRB. Selanjutnya, optimasi kondisi PCR dengan primer PHZ1/2 menghasilkan pita spesifik 1.6 kb lebih besar pada Pseudomonas sp. CRB 80 dan 102 dibandingkan dengan ukuran yang seharusnya 1.4 kb. BLASTN menunjukkan 785 bp dari sekuen lengkap tersebut paling mirip 92% dengan nukleotida phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase, class I dari Pseudomonas putida KT2440. BLASTX protein dari nukleotida yang ditranslasi menunjukkan kemiripan 242 asam amino dengan phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase, class I dari Pseudomonas putida GB-1. Phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase adalah gen phzF. PhzF adalah bagian dari 7 gen penyandi biosintesis fenazin pada Pseudomonas aureofaciens 30-84. Hasil ini menunjukkan bahwa bagian gen penyandi biosintesis fenazin, phzF, dapat terdeteksi dan terkonfirmasi pada Pseudomonas sp. CRB-80 dan CRB-102. Pada Pseudomonas sp. CRB yang lain, biosintesis senyawa anticendawan selain fenazin, pioluteorin, pirolnitrin atau diasetilfloroglusinol diperkirakan terlibat dalam antibiosis. Hampir semua Pseudomonas sp. CRB, kecuali CRB-3 pada tanah steril, dapat mengurangi jumlah tanaman yang menunjukkan gejala penyakit karena serangan cendawan patogen tular tanah dan memberikan penekanan penyakit. Perlakuan benih dengan Pseudomonas sp. CRB memberikan penekanan penyakit in planta sekitar 14.3-100% pada tanah steril dan 5.2-52.6% pada tanah non steril. Pseudomonas sp. CRB-16, CRB-44, CRB-86, CRB-102 dan CRB-109 yang masih menunjukkan penekanan penyakit cukup tinggi, lebih dari 30% pada tanah non steril dapat dipertimbangkan untuk dikembangkan sebagai agen pengendalian hayati untuk aplikasi ke lapang. Kerapatan populasi di rizosfer Pseudomonas sp. CRB-17, CRB-80 dan CRB-102 Rifr yang dipelajari kemampuan kolonisasinya antara 102-107 sel/g berat akar segar pada tanah steril dan 0-106 sel/g berat akar segar pada tanah non steril. Jumlah sel Pseudomonas sp. CRB-Rifr berkurang sedikit pada tanah non steril dibandingkan dengan pada tanah steril karena bakteri harus bertahan dan berkompetisi dengan mikrob lain yang telah ada di tanah sebelumnya. | id |
