Isolation and characterization of an aluminum tolerance gene in Rice

Abstract

Aluminum (Al) toxicity is the major limiting factor of crop production in acid soil. Aluminum tolerance in rice is considered as a quantitative trait controlled by many genes. The objectives of this research were to isolate, clone, characterize the aluminum tolerance gene, and to develope codominant marker for rice B11 gene. Plant materials used in this research were four rice genotypes namely Grogol, Hawara Bunar, IR64, and Krowal, and the F2 segregating rice population derived from a cross between Al-sensitive rice genotype IR64 and Altolerant rice genotype Hawara Bunar. A rice Al tolerance gene was isolated based on a combination between rye-rice syntenic relationship and RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) approaches. The cDNA of rice Al tolerance gene was synthesized from mRNA isolated from Hawara Bunar after being stressed under 15 ppm Al at pH 4.0 for 24 hours. The Al tolerance gene was characterized by sequencing, bioinformatically analyzing, and introducing it to tobacco plant. The inheritance pattern of rice Al tolerance gene was analyzed by developing the CAPS (Cleaved Amplified Polymorphism Sequence) codominant marker of rice Al tolerance gene through a series of PCR, sequencing, and restriction enzyme analysis of the PCR fragment from IR64 and Hawara Bunar, followed by testing the marker in F2 rice population. This research has succesfully cloned an Al tolerance gene from Indonesian local rice genotype Hawara Bunar, called B11 gene. The B11 gene expression was induced by Al with higher expression level in Hawara Bunar than that of IR64. Transgenic tobacco plants carrying the gene were more tolerant to Al stress than that of nontransgenic tobacco plants. The B11 protein was similar to bacterial ribosomal L32 proteins and was predicted as a transcription factor with bZIP domain and C2H2-zinc finger like motif. Comparison between the B11 gene sequences of the IR64 and Hawara Bunar showed 8 SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms). One of the SNPs located at nucleotide 668 causing AluI restriction site based polymorphism between IR64 and Hawara Bunar, which was then used as a basis of B11-CAPS codominant marker development. The marker segregation followed a single gene inheritance pattern. The marker might be used for MAS (Masrker Assisted Selection) in rice breeding programs to obtain Al-tolerant lines.

Aluminium (Al) merupakan salah satu faktor utama yang membatasi produksi tanaman pertanian di tanah masam. Tanaman yang toleran terhadap cekaman Al dapat diseleksi menggunakan parameter fisiologi terkait toleransi cekaman Al seperti kemampuan root re-growth (RRG) setelah tercekam Al. Toleransi tanaman padi terhadap cekaman Al merupakan sifat kuantitatif yang dikendalikan oleh banyak gen, namun gen yang mendasarinya masih belum diketahui. Penelitian ini bertujuan mengisolasi, mengklon, mengkarakterisasi, dan mengembangkan penanda molekuler kodominan dari gen toleran Al dari tanaman padi. Untuk mencapai tujuan tersebut, penelitian dibagi menjadi tiga tujuan, yaitu (1) menentukan konsentrasi dan waktu periode cekaman Al yang dapat membedakan respon terhadap cekaman Al pada tiga genotipe padi gogo lokal (Grogol, Hawara Bunar, dan Krowal) dan varietas padi sensitif Al (IR64), dan mengevaluasi keefektifan karakter RRG sebagai parameter toleransi tanaman padi terhadap cekaman Al; (2) mengisolasi dan mengkarakterisasi gen toleran Al dari genotipe padi yang toleran Al, kemudian mengintroduksi dan menguji ekspresinya pada tanaman model tembakau (Nicotiana tabacum L.); dan (3) mengembangkan penanda molekuler kodominan dari gen toleran Al yang dapat digunakan sebagai alat seleksi pada MAS (Marker Assisted Selection) dan mengidentifikasi pola pewarisannya pada populasi padi F2 hasil persilangan IR64 dan Hawara Bunar. Penentuan konsentrasi dan waktu periode cekaman Al dilakukan dengan 1) percobaan kultur hara menggunakan berbagai perlakuan konsentrasi Al di ruang pertumbuhan, 2) percobaan pot di rumah kaca menggunakan media tanah masam Podsolik Merah Kuning berkelarutan Al tinggi dengan pH 4.6, dan 3) phenotyping populasi padi F2. Isolasi gen dilakukan dengan kombinasi pendekatan sintenik antara padi dan rye (Secale cereale L.) dan RT-PCR (Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction) menggunakan cetakan berupa cDNA dari genotipe padi yang toleran Al yang telah mendapat cekaman 15 ppm Al pada pH 4.0 selama 24 jam. Karakterisasi dilakukan dengan pendekatan sekuensing, analisis bioinformatika, dan tembakau transgenik yang diintroduksi gen toleran Al. Pewarisan gen toleran Al dilakukan melalui analisis urutan nukleotida pada produk PCR dari genotipe/varietas padi toleran Al dan sensitif Al, analisis situs enzim restriksi, dan desain primer berdasarkan situs enzim restriksi yang memberikan polimorfisme pada kedua tetua, serta mengaplikasikannya pada populasi padi F2. Perlakuan 15 ppm Al selama 72 jam dapat membedakan genotipe padi yang toleran Al (Grogol dan Hawara Bunar) dari yang sensitif Al (IR64 dan Krowal). Percobaan pot menggunakan media tanah masam berkelarutan Al tinggi memberikan hasil yang sejalan dengan percobaan kultur hara. Nilai RRG tiap tanaman pada populasi padi F2 bervariasi yang mengindikasikan bahwa karakter RRG dapat digunakan untuk menyeleksi tanaman padi yang toleran Al pada populasi padi segregasi dan dapat dijadikan sebagai parameter toleransi cekaman Al pada tanaman padi. Gen B11 sebagai gen toleran Al telah berhasil diisolasi dari Hawara Bunar. Ekspresi gen B11 diinduksi oleh Al dan ekspresinya pada Hawara Bunar lebih tinggi daripada IR64. Gen B11 dapat meningkatkan toleransi tanaman tembakau transgenik terhadap cekaman Al. Protein B11 yang disandikannya mirip dengan protein L32 ribosomal bakteri dan diprediksi berperan sebagai faktor transkripsi dengan domain bZIP dan motif seperti C2H2-zinc finger. Urutan nukleotida dari gen B11 IR64 dan Hawara Bunar mengandung 8 polimorfisme nukleotida tunggal (SNPs). Salah satu SNPs menyebabkan polimorfisme berdasarkan situs enzim restriksi AluI dan ini kemudian menjadi dasar untuk membuat penanda molekuler kodominan B11-CAPS (Cleaved Amplified Polymorphism Sequence). Penanda molekuler B11-CAPS bersegregasi mengikuti pola pewarisan gen tunggal. Penanda molekuler B11-CAPS berpotensi sebagai alat seleksi pada program pemuliaan tanaman padi untuk mendapatkan genotipe padi yang toleran Al.