Genetic transformation of rice using rhizobium and agrobacterium and functional analysis of OsHox6 Gene

Abstract

Rice (Oryza sativa) is not only the most important crop in the world, but also a model plant for functional genomic studies. Genetic transformation is a routine technique for transferring important traits into plants including rice genome and for gene function analysis. Agrobacterium transformation technique is the most commonly used for genetic transformation of plants. However, the complexity of patents landscape surrounds this technology restricts its use for agricultural development in developing countries. In this study, the effectiveness of Rhizobium transformation techniques were evaluated in three rice cultivars Ciherang, Nipponbare, and Rojolele, and compared to Agrobacterium. Six-day old callus induced from immature embryos were co-cultivated with Rhizobium leguminosarum ANU845 and Agrobacterium tumefaciens LBA288 both carrying the plasmid pCAMBIA 5106. pCAMBIA 5106 is a cointegrative vector. The T-DNA contained an hpt gene and a GUSPlus each controlled by the CaMV 35S promoter. This study showed that the Rhizobium could transfer genes into rice genome as efficient as that of Agrobacterium based on evaluation on transformation efficiency, transgene expression, copy number, segregation pattern, and plant growth and fertility. Drought is one of abiotic factors that inhibit rice growth and production. A number of genes responsible for drought tolerance have been identified, isolated and tested in different plant species. However, none of these genes was effective in the fields. In this study, a drought inducible gene, OsHox6, was selected to be studied further. Bioinformatics analysis of OsHox6 promoter sequences indicated that the OsHox6 promoter contains cis-regulatory elements important to drought and ABA responses. Temporal and spatial expression patterns of GUSPlus gene fused to OsHox6 promoter through histochemical visualization of GUSPlus in transgenic plant of Ciherang and Nipponbare showed that promoter activity was increased during dehydrated condition in vegetative and generative organs, although the expression was relatively low. Promoter activity was higher in meristematic tissues. Transgenic rice plants containing an extra copy of OsHox6 genes controlled by OsLEA3 promoter were obtained. Four transgenic of IR64 lines (I.19, I.23, I.33, and I.40) containing an extra copy of OsHox6 gene were more tolerant to drought condition, showing higher survival rate compare to wild type plants. It is anticipated that the increase in the survival rate was associated with the expression level of OsHox6 gene. Thus, the expression of OsHox6 gene will be further evaluated. The growths of transgenic rice plants were similar to its wild type counterpart. Further studies are needed to understand the modulation of drought tolerant by the OsHox6 gene.

Padi merupakan tanaman yang sangat penting, salah satu makanan pokok penduduk dunia dan tanaman model untuk penelitian functional genomic. Transformasi genetik merupakan teknik yang rutin digunakan saat ini untuk mentransfer berbagai sifat penting pada tanaman termasuk padi dan untuk analisis fungsi gen. Teknik transformasi Agrobacterium merupakan teknik transformasi yang paling umum digunakan karena besar kemungkinan untuk mendapatkan tanaman dengan salinan gen tunggal. Namun, teknik ini telah dipatenkan sehingga perlu agen transformasi alternatif yang memiliki kemampuan transfer gen seperti Agrobacterium. Penggunaan bakteri selain Agrobacterium sebagai agen transformasi genetik memungkinkan untuk dilakukan dengan melibatkan T-DNA dan gen-gen virulen dari plasmid Ti yang telah dimodifikasi. Efektifitas teknik transformasi Rhizobium dievaluasi pada tiga kultivar padi, Ciherang (Indica), Nipponbare (Japonica), dan Rojolele (Javanica), dibandingkan dengan Agrobacterium. Kalus umur 6 hari yang diinduksi dari embrio padi masak susu (immature) dikokultivasi dengan Rhizobium leguminosarum bv trifolii ANU845 dan Agrobacterium tumefaciens LBA288 yang membawa plasmid pCAMBIA 5106. Plasmid pCAMBIA 5106 ini mengandung satu set minimal gen virulen dan T-DNA yang penting dalam proses transfer gen. Didalam T-DNA terdapat gen GUSPlus dan gen hpt masing-masing dikendalikan oleh promoter CaMV 35S. Efisiensi transformasi (jumlah tanaman PCR positif hpt dibagi jumlah kalus yang diinokulasi) bervariasi antara 1,14 hingga 12,05% tergantung pada genotipe dan bakteri yang digunakan. Efisiensi transformasi dan regenerasi tertinggi (12,05% dan 59,38%) diperoleh pada Ciherang yang ditransformasi dengan R. leguminosarum. Hampir semua tanaman transgenik yang diperoleh baik hasil transformasi dengan Agrobacterium maupun Rhizobium secara morfologi normal dan fertil. Integrasi, ekspresi dan pola pewarisan gen, dibuktikan dengan analisis molekuler dan genetik pada tanaman T0 dan T1 Kekeringan adalah salah satu faktor abiotik yang menghambat pertumbuhan dan produksi tanaman padi. Sejumlah gen yang bertanggungjawab pada sifat toleran kekeringan telah diidentifikasi, namun belum ada dari gen-gen tersebut yang efektif di lapangan. Oleh karena itu, penelitian tentang analisis fungsi gen yang diduga terlibat dalam mekanisme toleran kekeringan dan bagaimana mekanisme kerjanya pada level molekul aktif diteliti saat ini. Di dalam penelitian ini, fungsi gen OsHox6 yang diduga berperan penting dalam menentukan sifat toleran kekeringan pada tanaman padi dipelajari. OsHox6 merupakan anggota famili protein homeodomain leucine zipper (HD-Zip) sub-famili I yang menyandikan faktor transkripsi unik pada tumbuhan. Hasil penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa ekspresi gen OsHox6 diregulasi pada level transkripsi oleh ketersediaan air. Analisis bioinformatik sekuen promoter OsHox6 , menunjukkan bahwa efektifitas Rhizobium leguminosarum dalam melakukan transfer gen mirip dengan A. tumefaciens. mengindikasikan bahwa promoter OsHox6 mengandung elemen responsif terhadap ABA dan elemen cis-regulatory responsif terhadap kekeringan. TATA box yang umum dijumpai di derah promoter tanaman, berdasarkan hasil analisis sekuen promoter OsHox6, tidak ditemukan. Hasil analisis pola ekspressi temporal dan spasial promoter gen OsHox6 melalui visualisasi gen GUSPlus secara histokimia pada jaringan tanaman transgenik Ciherang dan Nipponbare menunjukkan bahwa aktivitas promoter ini meningkat saat kekeringan pada organ vegetatif (batang, daun, dan akar) dan generatif (bunga). Aktivitas promoter lebih kuat pada daerah dimana terdapat jaringan meristem yang aktif membelah. Untuk mempelajari peranan gen OsHox6 dalam merespon kekeringan, digunakan tanaman padi transgenik mengandung gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3 untuk meningkatkan ekspresi gen OsHox6. Empat galur padi transgenik mengandung ekstra salinan gen OsHox6 (IR64 I.19, I.23, I.33, dan I.40) lebih tahan pada kondisi kekeringan pada fase vegetatif, ditunjukkan oleh persentase recovery yang lebih tinggi dibandingkan dengan tanaman kontrol tipe liarnya (IR64). Diduga peningkatan persentase recovery berhubungan dengan tingkat ekspresi gen OsHox6. Oleh karena itu konfirmasi ekspresi gen OsHox6 akan dilakukan. Penampilan morfologi (tinggi tanaman) padi hasil transformasi dengan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3 tidak berbeda dengan tanaman padi tipe liarnya. Karena aktivitas promoter OsHox6 lebih tinggi pada daerah akar lateral, maka diduga OsHox6 penting dalam pembentukan akar lateral. Oleh karena itu penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengamati morfologi akar tanaman transgenik yang mengoverekspresikan OsHox6.