Antigen ekskretori/sekretori stadium L3 ascaridia galli sebagai pemicu pembentukan imunoglobin yolk (IgY) pada ayam petelur

Abstract

Ascaridiosis disebabkan oleh infeksi cacing nematoda parasitik Ascaridia galli. Penelitian telah dilakukan untuk mendapatkan antigen ekskretori/sekretori stadium L3 A. galli sebagai pemicu pembentukan imunoglobulin Y (IgY) anti-ascaridiosis pada ayam petelur. Dosis 6000 L2 diberikan kepada 100 ekor ayam, dan tujuh hari kemudian larva yang sudah menetas (L3) diambil kembali dari dalam usus halus. L3 dikultur secara in vitro (5 - 10/ml) dalam rosswell park memorial institute (RPMI 1640), pH 6,8, tanpa merah fenol dalam inkubator pada temperatur 37oC dan 5% CO2 selama 3 hari. Untuk mendapatkan antigen ekskretori/sekretori, medium kultur dipekatkan dengan vivaspin 30.000 MWCO, dan kuantitas protein antigen dihitung dengan metode Bradford. Berat molekul ekskretori/sekretori ditentukan dengan sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE). Imunisasi aktif pertama pada ayam dengan dosis 80 μg diaplikasikan secara intramuskular. Imunisasi diulang tiga kali dengan dosis 60 μg dalam interval waktu satu minggu. Pada imunisasi pertama, antigen ekskretori/sekretori dicampur dalam fruend adjuvant complete dan imunisasi selanjutnya antigen dicampur dalam freund adjuvant incomplete. Telur ayam dikoleksi mulai hari ke-49 pascaimunisasi. Anti-ascaridiosis IgY diekstraksi dari kuning telur dengan menggunakan ammonium sulphate dan dipurifikasi melalui fast performance liquid chromatography (FPLC). Kuantitas IgY murni ditentukan dengan metode Bradford (λ = 280 nm). Antibodi dideteksi dengan uji agar gel precipitation test (AGPT) dan enzyme linked immunosorbant assay (ELISA). Deteksi antigen A. galli dilakukan secara imunohistokimia. Potensi IgY diuji terhadap populasi cacing A. galli secara in vivo. Ayam ditantang dengan dosis 1000 L2 A. galli. Ayam dimunisasi pasif setiap hari dengan dosis 0,875 mg secara oral selama 10 hari. Hasil menunjukkan bahwa persentase L2 yang berkembang menjadi L3 adalah 12.7%. Konsentrasi protein antigen ekskretori/sekretori adalah 0,595 mg/ml dengan berat molekul 28 kDa. Konsentrasi protein IgY setelah dipurifikasi adalah 0,875 ± 0.251 mg/ml. Uji AGPT menunjukkan bahwa antibodi mulai positif pada minggu keempat pascaimunisasi. Titer tertinggi kelompok ayam yang diimunisasi adalah 2,63 ± 1,20 OD (optical density) dicapai pada minggu ketiga dan titer terendah adalah 1,51 ± 0,48 OD dicapai pada minggu kenol pascainfeksi. IgY dapat mengenal keberadaan antigen pada bagian kutikula dan saluran cerna A. galli. Peningkatan titer antibodi berkorelasi positif dengan jumlah kelangsungan hidup cacing dalam saluran cerna (worm burden) 12 minggu pascainfeksi. Kombinasi imunisasi aktif dan pasif secara signifikan menurunkan secara signifikan (P < 0,05) populasi cacing A. galli di dalam usus halus ayam petelur. Antigen ekskretori/sekretori dapat memicu respons imunitas humoral terhadap penyakit parasit yang disebabkan oleh A. galli. Hasil tersebut merefleksikan bahwa produk ekskretori/sekretori L3 A. galli mengandung antigen, dan antibodi berperan dalam mekanisme imunitas inang terhadap A. galli.

Ascaridiosis caused by the nematode Ascaridia galli. A study was carried out to characterize excretory/secretory antigen of A. galli from larval stage to trigger anti-ascaridiosis yolk immunoglobulin in laying hens. A. galli L3 were recovered from intestines of 100 heads chickens 7 days after oesophagus inoculation with 6000 L2. L3 recovered in this manner were cultured (5 – 10 ml-1) in flasks containing rosswell park memorial institute (RPMI) 1640 media, pH 6.8, without phenol red. Cultures were incubated at 370C in 5% CO2 and culture fluid was collected after 3 days in culture. To prepare excretory/secretory antigen, culture medium were concentrated with vivaspin 30.000 MWCO, and antigen protein concentration were counted as described in Bradford method. The molecular weight of excretory/secretory antigen was determined with sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE). Active immunizations were applied intra muscularly of chickens with an initial dose of 80 μg. The immunizations were repeated three times with dose of each 60 μg with an interval of one week. The first immunizations were excretory/secretory antigen mixed with fruend adjuvant complete and subsequently mixed with freund adjuvant incomplete. The chicken’s eggs were collected from 49 day after immunizations. Anti-ascaridiosis yolk immunoglobulin (IgY) was extracted from egg yolks by means of ammonium sulphate and purified using fast performance liquid chromatography (FPLC). The purity of anti-ascaridiosis IgY was determined by Bradford method (λ = 280 nm). Antibody was detected by agar gel precipitation test (AGPT) and enzyme linked immunosorbant assay (ELISA). Antigen were detected with immunohistochemistry. Chickens were challanged with dose of 1000 L2 A. galli. Passive immunizations were applied ten times with dose of each 0,875 mg IgY with an interval of one day intra orally. IgY anti-ascaridiosis was tested against A. galli survival in vitro.