| dc.description.abstract | Produksi lipase bakteri secara heterolog memiliki beberapa kendala ketika
diekspresikan dalam sistem ekspresi protein eukariotik seperti Pichia pastoris.
Dalam penelitian ini, gen lipase T1.2RQ dari Geobacillus stearothermophilus T1.2
diekspresikan pada P. pastoris GS115 melalui strategi yang melibatkan multikopi
gen lipase, menghasilkan peningkatan aktivitas lipase. Tiga kopi gen lipase dalam
plasmid rekombinan pPIC9K_T1.2RQ(3X) diintegrasikan ke dalam genom P.
pastoris GS115, dan analisis kuantitatif menggunakan teknik qPCR
mengkonfirmasi bahwa galur transforman GS115 mengandung enam kopi gen
T1.2RQ, menunjukkan dua kali terjadi integrasi. Pengukuran aktivitas lipase
menunjukkan bahwa galur GS115/T1.2RQ(6X) mengalami peningkatan 111%
dibandingkan dengan yang mengandung 1 kopi gen T1.2RQ. Hasil SDS-PAGE
dan Zymogram menunjukkan pita protein dengan ukuran 43kDa. Analisis kualitatif
pada media LBA+Trybutyrin dari semua galur yang mengandung gen T1.2RQ
menunjukkan zona bening. Produksi lipase dalam fermentasi labu membutuhkan
waktu setidaknya 120 jam untuk menghasilkan aktivitas lipase terbaik. Dengan
demikian, strategi dengan beberapa salinan gen lipase telah secara signifikan (P <
0,05) meningkatkan ekspresi gen lipase bakteri di P. pastoris GS115, dan pertama
kali dilakukan pada lipase dari G. stearothermophilus T1.2.
Gen hac1, yang merupakan aktivator transkripsi pada mekanisme respon
protein yang tidak diterjemahkan (Untranslated Protein Response), diekspresikan
bersama dalam P. pastoris GS115 untuk meningkatkan produksi lipase dari G.
stearothermophilus. Plasmid rekombinan pPICZAwbe_hac1 ditransformasi ke
dalam P. pastoris yang telah memiliki multikopi lipase (1X dan 4X) untuk
memperoleh galur khamir transforman GS115 / T1.2RQ (1X) _hac1 dan GS115 /
T1.2RQ (4X) _hac1. Galur GS115/T1.2RQ(1X)_hac1 menunjukkan peningkatan
aktivitas lipase sebesar 86% setelah 120 jam fermentasi, sedangkan galur
GS115/T1.2RQ(4X)_hac1 menunjukkan peningkatan awal yang lebih cepat (38%
pada 48 jam fermentasi) dan 28% pada 120 jam. Uji SDS-PAGE dan kualitatif di
media LBA+Tributyrin mengkonfirmasi ekspresi lipase ekstraseluler (~43 kDa)
sesuai dengan ukuran gen T1.2RQ ~1200 bp. Hasil ini menunjukkan bahwa
ekspresi bersama hac1 secara signifikan (t-test,p=0,01) meningkatkan produksi
lipase pada P. pastoris, terutama pada konstruksi salinan / kopi yang lebih rendah.
Ekspresi gen lipase G, stearothermophilus T1.2RQ dalam beberapa salinan
(multikopi) telah meningkatkan produksi protein. Strategi multikopi gen dan
ekspresi bersama gen bmh2 dan sso2 dilakukan untuk meningkatkan sekresi lipase
ekstraseluler T1.2RQ pada P. pastoris. Transforman GS115 / T1.2RQ (6X), yang
berisi enam salinan gen lipase, menunjukkan aktivitas tertinggi, digunakan sebagai
cetakan untuk membuat kaset ekspresi bmh2 dan sso2. Gen bmh2 (797 bp) dan sso2
(875 bp) dikloning ke dalam vektor pPICZAwbe, dan ditansformasi untuk
memperoleh khamir transforman GS115/T1.2RQ(6X)_bmh2 dan
iv
GS115/T1.2RQ(6X)_sso2. Koloni transforman GS115/T1.2RQ(6X)_bmh2#3
menunjukkan peningkatan aktivitas lipase sebesar 71% dibandingkan dengan
kontrol GS115/T1.2RQ(6X), sedangkan GS115/T1.2RQ(6X)_sso2#1
menunjukkan penurunan 23%. Berdasarkan data yang diperoleh, diantara dua
protein chaperone yang diuji, Bmh2 adalah yang paling efektif dalam
meningkatkan aktivitas lipase (P<0,05), kemungkinan karena memfasilitasi ekspor
protein heterolog dari retikulum endoplasma dan pelipatan protein yang benar.
Analisis SDS-PAGE menunjukkan pita protein lipase 43 kDa, dan uji kualitatif
menggunakan media agar tributyrin mengkonfirmasi aktivitas lipase ekstraseluler
pada P. pastoris GS115. Pada produksi biodiesel (Fatty Acid Methyl Ester/FAME),
lipase yang diekspresikan mengkatalisis esterifikasi PFAD (Palm Fatty Acid
Distillated), mengurangi kandungan asam lemak bebas (FFA) menjadi 4,9%,
sehingga memenuhi standar mutu biodiesel (SNI 7182:2015). Analisis gas
kromatografi (GC) menunjukkan bahwa kandungan FAME yang dominan adalah
metil ester palmitat dan stearat. Penelitian ini menunjukkan bahwa gen bmh2 adalah
protein chaperone yang paling efektif secara signifikan (P < 0,05) untuk ekspresi
bersama gen lipase enam salinan/ kopi, meningkatkan aktivitas lipase ekstraseluler.
Enzim yang dihasilkan melalui ekspresi heterolog di P. pastoris dapat digunakan
untuk produksi biodiesel skala laboratorium, sebanding dengan hasil ekspresi
heterolog pada E. coli. Ini pertama kali dilaporkan dari lipase G.
stearothermophilus T1.2. Hasil penelitian ini berdampak positif pada penelitian
ekspresi gen lipase bakteri pada sistem ekspresi eukariot P. pastoris. | |
