Peningkatan Produksi Lipase T1.2RQ di Pichia pastoris Melalui Multikopi Gen Lipase dan Ekspresi Bersama Chaperone

Abstract

Produksi lipase bakteri secara heterolog memiliki beberapa kendala ketika diekspresikan dalam sistem ekspresi protein eukariotik seperti Pichia pastoris. Dalam penelitian ini, gen lipase T1.2RQ dari Geobacillus stearothermophilus T1.2 diekspresikan pada P. pastoris GS115 melalui strategi yang melibatkan multikopi gen lipase, menghasilkan peningkatan aktivitas lipase. Tiga kopi gen lipase dalam plasmid rekombinan pPIC9K_T1.2RQ(3X) diintegrasikan ke dalam genom P. pastoris GS115, dan analisis kuantitatif menggunakan teknik qPCR mengkonfirmasi bahwa galur transforman GS115 mengandung enam kopi gen T1.2RQ, menunjukkan dua kali terjadi integrasi. Pengukuran aktivitas lipase menunjukkan bahwa galur GS115/T1.2RQ(6X) mengalami peningkatan 111% dibandingkan dengan yang mengandung 1 kopi gen T1.2RQ. Hasil SDS-PAGE dan Zymogram menunjukkan pita protein dengan ukuran 43kDa. Analisis kualitatif pada media LBA+Trybutyrin dari semua galur yang mengandung gen T1.2RQ menunjukkan zona bening. Produksi lipase dalam fermentasi labu membutuhkan waktu setidaknya 120 jam untuk menghasilkan aktivitas lipase terbaik. Dengan demikian, strategi dengan beberapa salinan gen lipase telah secara signifikan (P < 0,05) meningkatkan ekspresi gen lipase bakteri di P. pastoris GS115, dan pertama kali dilakukan pada lipase dari G. stearothermophilus T1.2. Gen hac1, yang merupakan aktivator transkripsi pada mekanisme respon protein yang tidak diterjemahkan (Untranslated Protein Response), diekspresikan bersama dalam P. pastoris GS115 untuk meningkatkan produksi lipase dari G. stearothermophilus. Plasmid rekombinan pPICZAwbe_hac1 ditransformasi ke dalam P. pastoris yang telah memiliki multikopi lipase (1X dan 4X) untuk memperoleh galur khamir transforman GS115 / T1.2RQ (1X) _hac1 dan GS115 / T1.2RQ (4X) _hac1. Galur GS115/T1.2RQ(1X)_hac1 menunjukkan peningkatan aktivitas lipase sebesar 86% setelah 120 jam fermentasi, sedangkan galur GS115/T1.2RQ(4X)_hac1 menunjukkan peningkatan awal yang lebih cepat (38% pada 48 jam fermentasi) dan 28% pada 120 jam. Uji SDS-PAGE dan kualitatif di media LBA+Tributyrin mengkonfirmasi ekspresi lipase ekstraseluler (~43 kDa) sesuai dengan ukuran gen T1.2RQ ~1200 bp. Hasil ini menunjukkan bahwa ekspresi bersama hac1 secara signifikan (t-test,p=0,01) meningkatkan produksi lipase pada P. pastoris, terutama pada konstruksi salinan / kopi yang lebih rendah. Ekspresi gen lipase G, stearothermophilus T1.2RQ dalam beberapa salinan (multikopi) telah meningkatkan produksi protein. Strategi multikopi gen dan ekspresi bersama gen bmh2 dan sso2 dilakukan untuk meningkatkan sekresi lipase ekstraseluler T1.2RQ pada P. pastoris. Transforman GS115 / T1.2RQ (6X), yang berisi enam salinan gen lipase, menunjukkan aktivitas tertinggi, digunakan sebagai cetakan untuk membuat kaset ekspresi bmh2 dan sso2. Gen bmh2 (797 bp) dan sso2 (875 bp) dikloning ke dalam vektor pPICZAwbe, dan ditansformasi untuk memperoleh khamir transforman GS115/T1.2RQ(6X)_bmh2 dan iv GS115/T1.2RQ(6X)_sso2. Koloni transforman GS115/T1.2RQ(6X)_bmh2#3 menunjukkan peningkatan aktivitas lipase sebesar 71% dibandingkan dengan kontrol GS115/T1.2RQ(6X), sedangkan GS115/T1.2RQ(6X)_sso2#1 menunjukkan penurunan 23%. Berdasarkan data yang diperoleh, diantara dua protein chaperone yang diuji, Bmh2 adalah yang paling efektif dalam meningkatkan aktivitas lipase (P<0,05), kemungkinan karena memfasilitasi ekspor protein heterolog dari retikulum endoplasma dan pelipatan protein yang benar. Analisis SDS-PAGE menunjukkan pita protein lipase 43 kDa, dan uji kualitatif menggunakan media agar tributyrin mengkonfirmasi aktivitas lipase ekstraseluler pada P. pastoris GS115. Pada produksi biodiesel (Fatty Acid Methyl Ester/FAME), lipase yang diekspresikan mengkatalisis esterifikasi PFAD (Palm Fatty Acid Distillated), mengurangi kandungan asam lemak bebas (FFA) menjadi 4,9%, sehingga memenuhi standar mutu biodiesel (SNI 7182:2015). Analisis gas kromatografi (GC) menunjukkan bahwa kandungan FAME yang dominan adalah metil ester palmitat dan stearat. Penelitian ini menunjukkan bahwa gen bmh2 adalah protein chaperone yang paling efektif secara signifikan (P < 0,05) untuk ekspresi bersama gen lipase enam salinan/ kopi, meningkatkan aktivitas lipase ekstraseluler. Enzim yang dihasilkan melalui ekspresi heterolog di P. pastoris dapat digunakan untuk produksi biodiesel skala laboratorium, sebanding dengan hasil ekspresi heterolog pada E. coli. Ini pertama kali dilaporkan dari lipase G. stearothermophilus T1.2. Hasil penelitian ini berdampak positif pada penelitian ekspresi gen lipase bakteri pada sistem ekspresi eukariot P. pastoris.