Extracellular Vesicles Functionalized Porous Phosphate Scaffold Enhances Bone Regeneration In Sheep Methaphyseal Tibial Defect

Abstract

A critical bone defect is a loss of bone structure that exceeds the critical size of the bone's ability to regenerate. They are commonly caused by trauma, chronic inflammation, metabolic disorders, or post-tumor resection. Bone defects not only interfere with the bone healing process but also aggravate morbidity for the patient, thus becoming one of the main problems in the field of orthopedics. In principle, bone healing requires mechanical stability, osteoinductive, osteoconductive, and osteogenic cells which are lost in critical bone defect conditions. To overcome this problem, a substitute material is needed as an intermediary between the bone and the regeneration process. Not only as a mechanical bridge, the replacement material must have good bioactivity, biocompatibility and biodegradability. Phosphate-Based Porous Bioactive Glass (P30) has been investigated to have the required characteristics. In addition, the addition of biologically active agents can enhance osteoinductive and osteogenesis. Currently, the focus of biological active agent research is shifting from cell-based to non-cell-based, one of which is Extracellular Vesicle (EV). EVs have stem cell-like characteristics in terms of bone healing efficacy but don’t served as cell itself in terms of structure and differentiation. with low immunogenicity and can be mass produced. In this study, the effectiveness of EVs and various concentration P30 were tested under in vitro and in vivo conditions. Phosphate Based Porous Bioactive Glass (P30) as EV-loading biomaterials were fabricated via the speroidization method. Meanwhile, EVs were obtained from purified human umbilical cord secretome as extraction source. In the invitro test, extracellular vesicles (EV) will be loaded on porous bioactive glass microspheres with various concentrations, then the efficacy of EV on microspheres based on osteogenesis, EV uptake, and cell migration will be evaluated. The in vivo test used local female sheep (Ovis Aries) as the experimental animal. A cylindrical defect measuring 15 mm x 8 mm was made by drilling using a drill, then three treatments will be applied to the bone defect including hydroxy apatite, Phosphate- Based Porous Bioactive Glass (P30) and P30+EV. Radiology, osteogenesis, and angiogenesis measurements were taken on days 28 and 56. Based on in vitro studies, observation of osteogenesis on days 7 and 14 showed that P30 concentrations of 100 µg were significantly higher than the control group. Similarly, in the EV uptake test results, concentrations of 100 µg were significantly higher than the control group. While in the cell migration test, P30 500 µg concentration had a significantly higher value. The findings in the in vitro test revealed that the highest effectiveness for osteogenesis and EV uptake was obtained at P30 levels of 100 µg. Optimal osteogenesis was obtained from balanced P30 levels for

biodegradability and mineralization. Correspondingly, effective EV uptake was obtained with the speed of EV release in accordance with the cell's capability for EV uptake. While at a concentration of 500 µg, the bioactive signal was strong enough to induce pre-osteoblastic migration. Based on the in vivo study, the defect size in the radiological test group was significantly smaller than the negative control at day 28 and 56. Correspondingly, the highest number of osteoblasts was also found in the P30+EV group. Furthermore, osteogenesis analysis based on RUNX2 expression showed the area with the highest RUNX2 positivity in P30+EV. Similarly, in angiogenesis analysis, the highest CD31 positive area was found in P30+EV. IRS Score analysis also showed similar results. The findings in thein vivo test prove that the combination of P30+EV can be applied in sheep animal models with good effectiveness.

Defek tulang adalah hilangnya struktur tulang, sedangkan defek tulang yang melebihi ukuran sehingga tulang tidak mampu untuk melakukan regenerasi, sehingga dibutuhkan bahan pengganti tulang (bone graft). Defek tulang umumnya disebabkan oleh trauma, peradangan tulang kronik, gangguan metabolik, atau pasca reseksi tumor. Defek tulang tidak hanya mengganggu proses penyembuhan tulang tetapi juga memperberat morbiditas bagi pasien sehingga menjadi salah satu masalah utama pada bidang orthopedi. Pada prinsipnya, penyembuhan tulang membutuhkan stabilitas mekanik, osteoinduktif, osteokonduktif, dan sel osteogenik yang dimana hilang pada kondisi defek tulang kritis. Guna mengatasi permasalahan ini, bahan pengganti diperlukan sebagai perantara antara tulang untuk proses regenerasi. Tidak hanya sebagai jembatan mekanik, bahan pengganti harus memiliki bioaktifitas, biokompatibilitas dan biodegradabilitas yang baik. Kaca bioaktif berpori berbasis fosfat (P30) telah diteliti memiliki karakteristik yang dibutuhkan. Selain itu, penambahan agen aktif biologis dapat meningkatkan osteoinduktif dan osteogenesis. Saat ini, fokus penelitian agen aktif biologi mulai bergeser dari berbasis sel ke non- sel, salah satunya adalah Extracellular Vesicle (EV). EV memiliki karakteristik seperti stem cell berdasarkan efek penyembuhan tulang yang diberikan, tetapi tidak berperan sebagai mana mestinya stem sel secara ukuran dan diferensiasi, namun dengan imunogenisitas yang rendah dan dapat diproduksi masal. Pada studi ini, efektivitas EV dan beragam konsentrasi P30 diuji pada kondisi in vitro dan in vivo. Kaca bioaktif berpori berbasis fosfat (P30) sebagai biomaterial yang ditambahkan dengan EV difabrikasi melalui metode speroidisasi. Sementara itu EV diperoleh dari purifikasi sekretom tali pusat manusia sebagai sumber ekstraksi. Pada uji in vitro akan dimuat EV pada kaca bioaktif berpori berbasis fosfat (P30) dengan berbagai konsentrasi, kemudian dievaluasi efikasinya berdasarkan osteogenesis, EV uptake, dan migrasi sel. Uji in vivo menggunakan hewan coba berupa domba lokal betina (Ovis Aries). Defek silindrikal berukuran 15 mm x 8 mm dibuat dengan pengeboran menggunakan bor, kemudian tiga perlakuan akan diaplikasikan pada defek tulang antara lain hidroksi apatit, kaca bioaktif berpori berbasis fosfat (P30) dan kaca bioaktif berpori berbasis fosfat (P30) dengan muatan EV. Pengukuran radiologi, osteogenesis, dan angiogenesis dilakukan pada hari ke 28 dan 56. Berdasarkan studi in vitro, observasi osteogenesis pada hari ke-7 dan ke-14 menunjukan konsentrasi P30 100 µg signifikan lebih tinggi dibandingkan kelompok kontrol. Begitu pula pada hasil uji uptake EV, konsentrasi P30 100 µg signifikan lebih tinggi dibandingkan kelompok kontrol. Sedangkan pada uji invasi sel, konsentrasi P30 500 µg memiliki nilai yang signifikan lebih tinggi. Temuan pada uji in vitro mengungkapkan bahwa efektivitas tertinggi untuk osteogenesis dan uptake EV didapatkan pada kadar P30 100 µg. Osteogenesis yang optimal didapat dari kadar P30 yang seimbang untuk biodegradabilitas dan mineralisasi. Sejalan dengan itu, internalisasi EV yang efektif didapatkan dengan kecepatan pelepasan EV yang sesuai dengan kapabilitas sel untuk internalisasi EV. Sedangkan pada konsentrasi 500 µg, sinyal bioaktif cukup kuat untuk menginduksi migrasi pre-osteoblastik. Berdasarkan studi in vivo, ukuran defek pada kelompok uji radiologi signifikan lebih kecil dibandingkan kontrol negatif pada hari ke-28 dan ke-56. Sejalan dengan itu, jumlah osteoblast tertinggi juga didapatkan pada kelompok P30+EV. Analisis osteogenesis berdasarkan ekspresi RUNX2 menunjukkan luas area dengan positif RUNX2 tertinggi pada P30+EV. Begitu pula pada analisis angiogenesis, positif CD31 area tertinggi didapatkan pada P30+EV. Pada IRS Score juga didapatkan hasil yang serupa. Temuan pada uji in vivo membuktikan pada kombinasi P30+EV dapat diterapkan pada model hewan domba dengan efektivitas yang baik.