Potensi Nanopartikel Kitosan dan Ekstrak Daun Bugenvil untuk Mengendalikan Infeksi Bean common mosaic virus Strain Blackeye cowpea (BCMV-BlC) dan Vektornya Aphis craccivora Koch.

Abstract

Bean common mosaic virus strain Blackeye cowpea (BCMV-BlC) merupakan virus penting penyebab penyakit mosaik pada kacang-kacangan terutama kacang panjang. Infeksi BCMV-BlC pada tanaman kacang panjang umur 1–4 minggu setelah tanam (MST) menunjukkan insidensi penyakit sebesar 100%, penurunan produksi polong per hektar sebesar 44,9% jika tanaman terinfeksi BCMV-BlC umur 1 MST. Kitosan dan ekstrak kasar daun bugenvil dilaporkan mampu mengendalikan BCMV-BlC. Namun, efisiensi penggunaan keduanya dalam skala lapangan dan keefektifannya perlu ditingkatkan, diantaranya dalam bentuk nanopartikel (NP). Penelitian bertujuan (1) menyintesis nanopartikel kitosan, ekstrak daun bugenvil, dan kombinasinya serta mengarakterisasi NP, (2) seleksi waktu dan penentuan konsentrasi terbaik NP dalam menekan infeksi BCMV-BlC pada tanaman indikator Chenopodium amaranticolor, (3) menguji pengaruh NP terhadap preferensi dan mortalitas kutudaun, dan (4) mengevaluasi potensi NP untuk mengendalikan kutudaun vektor dan BCMV-BlC. Daun bugenvil diekstraksi dengan metode maserasi bubuk daun dalam etanol 96% dan dibiarkan dalam ruang gelap selama 24 jam pada suhu ruang 25-26?. Kemudian, ekstrak etanol daun bugenvil dipekatkan menggunakan rotary evaporator hingga berbentuk pasta kental. Nanopartikel kitosan (Kit-NP), ekstrak daun bugenvil (EDB-NP), dan kombinasinya (KEDB-NP) disintesis menggunakan metode gelasi ionik dengan modifikasi. Karakterisasi NP dilakukan dengan pengamatan dibawah transmission electron microscope (TEM) untuk mengetahui ukuran partikel, scanning electron microscope (SEM) untuk mengetahui morfologi partikel, dan fourier transform infrared (FTIR) untuk menentukan gugus fungsi pada NP. Seleksi dan penentuan konsentrasi kitosan, ekstrak daun bugenvil, dan kombinasinya serta waktu aplikasi (NP dan non-NP) yang terbaik dilakukan dengan bioassay pada tanaman indikator C. amaranticolor. Waktu aplikasi dilakukan sebelum dan setelah 24 jam tanaman diinokulasi BCMV-BlC. Perlakuan NP kitosan, ekstrak daun bugenvil, dan kombinasinya diuji pada konsentrasi 100–800 ppm. Parameter yang diamati, yaitu periode inkubasi, jumlah lesio lokal nekrotik (LLN), dan tingkat hambatan relatif (THR) pembentukan LLN. Kemampuan Kit-NP, Kit, EDB-NP, EDB, KEDB-NP, dan KEDB terhadap preferensi makan dan mortalitas kutudaun Aphis craccivora Koch diuji dengan choice test menggunakan tiga konsentrasi terbaik hasil bioassay. Tanaman yang telah disemprot NP dimasukkan ke dalam kotak serangga. Semua tanaman uji diletakkan mengelilingi kertas karton coklat yang berada pada permukaan polibag, pada bagian tengah karton diinfestasi 25 imago kutudaun bebas virus yang tidak bersayap. Parameter yang diamati adalah jumlah kutudaun per tanaman pada 1, 3, 6, dan 12 jam setelah infestasi (JSI) serta mortalitas kutudaun pada 12, 24, dan 48 jam setelah perlakuan (JSP) dan Lethal Concentration 50% (LC50) dan 95% (LC95). Kemampuan Kit-NP, Kit, EDB-NP, EDB, KEDB-NP, dan KEDB untuk mengendalikan infeksi BCMV-BlC pada tanaman kacang panjang dievaluasi dalam percobaan di rumah kaca. Konsentrasi terbaik larutan NP dan non-NP disemprotkan pada daun tanaman umur 1 MST sebelum inokulasi BCMV-BlC. Parameter yang diamati yaitu periode inkubasi, insidensi dan keparahan penyakit, titer virus, ekspresi gen ketahanan PR3, aktivitas enzim polifenol oksidase (PPO), dan parameter agronomi. Titer virus dideteksi secara serologi, sedangkan gen PR3 dideteksi dengan RT-PCR. Kit-NP, EDB-NP, dan KEDB-NP berhasil disintesis dengan metode gelasi ionik yang dimodifikasi. Ukuran rata-rata partikel Kit-NP, EDB-NP, dan KEDB NP berturut-turut adalah 99,72 nm, 163,68 nm, dan 221,42 nm. Morfologi ketiganya adalah bentuk bola (spherical/sferis). KEDB menunjukkan panjang gelombang (cm-1) dan ikatan pada 3315 (O–H), 2975 (–CH3), 2832 (–CH3), 2238 (C–I), 2147 (C=C), 2014 (–SCN), 1650 (>N–H), 1392 (–CH3), 1014 (>CH3) dan 624 (C–H) yang merupakan gugus fungsi hidroksil, alkana, senyawa alifatik organohalogen, alkuna, nitrogen, karbonil, dan amina. Sementara, KEDB-NP menunjukkan puncak panjang gelombang (cm-1) dan ikatan pada 3285 (O–H), 2142 (O–H), 1632,8 (>N–H), 689 (C–H), dan 592 (C–I) yang merupakan gugus fungsi hidroksil, alkena, amina, cincin aromatik, dan senyawa alifatik organohalogen. Penyemprotan daun C. amaranticolor dengan Kit-NP, Kit, EDB-NP, EDB, KEDB-NP, dan KEDB pada konsentrasi 100–800 ppm sebelum inokulasi virus secara nyata menunjukkan periode inkubasi lebih panjang (6 hari setelah inokulasi HSI) dibandingkan perlakuan sesudah inokulasi virus (5 HSI) dan kontrol tanpa perlakuan (4 HSI). Perlakuan NP mampu menekan LLN dengan tingkat hambatan relatif berkisar 67%-100% dibandingkan dengan aplikasi setelah inokulasi virus. Diantara delapan konsentrasi yang diuji, konsentrasi 100–300 ppm yang diaplikasikan sebelum inokulasi virus menunjukkan keefektifan yang tidak berbeda nyata dibandingkan konsentrasi yang lebih tinggi dalam menghambat pembentukan LLN. Namun, beberapa perlakuan sesudah inokulasi virus dengan konsentrasi > 300 ppm menunjukkan penghambatan LLN yang tinggi. Penyemprotan daun dengan Kit, EDB-NP, EDB, KEDB-NP, dan KEDB pada 1, 3, dan 6 JSI menunjukkan jumlah kutudaun tidak berbeda nyata dengan kontrol tanpa perlakuan. Pada 12 JSI, tanaman yang disemprot dengan Kit-NP dan EDB NP menunjukkan jumlah kutudaun lebih sedikit dibandingkan dengan jumlah kutudaun pada tanaman kontrol. Mortalitas kutudaun yang disemprot langsung dengan NP pada 12 dan 24 JSP tidak berbeda nyata dengan mortalitas kutudaun kontrol. Namun pada 48 JSP, perlakuan Kit-NP, EDB-NP, dan KEDB serta non NP pada konsentrasi 200 ppm dan 300 ppm menunjukkan mortalitas kutudaun antara 40%–66,6% dan 54,6%–78,6% yang nyata lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol. LC50 dan LC95 berkisar 427,7-815,5 ppm dan 881,5-4019,6 ppm pada 24 JSP dan LC95 berkisar 127,8-237,5 ppm dan 608,5-1706,7 ppm pada 48 JSP, Berdasarkan hasil penelitian, kitosan dan ekstrak daun bugenvil (NP dan non NP) perlakuan tunggal pada konsentrasi 100–300 ppm sebelum inokulasi BCMV BlC memperpanjang periode inkubasi dan mengurangi skor keparahan penyakit (0,8–1,2) dibandingkan skor keparahan penyakit kontrol sakit tanpa perlakuan (3,3). Gejala penyakit yang muncul pada perlakuan tunggal dikategorikan sebagai gejala ringan (mosaik ringan dan vein clearing ringan). Perlakuan EDB-NP dan Kit-NP pada konsentrasi 300 ppm secara nyata dapat menurunkan titer virus sebesar 69,4%. Perlakuan kitosan mampu menginduksi ekspresi gen PR3 pada konsentrasi 100 ppm saja dan menginduksi enzim PPO bersama dengan perlakuan Kit-NP lebih tinggi dibandingkan kontrol sakit tanpa perlakuan dan perlakuan lainnya.

Bean common mosaic virus strainBlackeye cowpea (BCMV-BlC) is an important virus that causes mosaic disease in beans, especially long beans. BCMV BlCinfection in long bean plants aged 1-4 weeks after planting (MST) shows a disease incidence of 100%, and a decrease in pod production per hectare of 44.9% if plants are infected with BCMV-BlCaged 1 MST. Chitosan and crude extract of bougainvillea leaves are reported to be able to control BCMV-BlC. However, the efficiency of using both on a field scale and their effectiveness need to be improved, including in the form of nanoparticle (NP). The research aims to (1) synthesize chitosan nanoparticles, bougainvillea leaf extract, and their combination and characterize NP, (2) select time and determine the best concentration of NP in suppressing BCMV-BlC infection on the indicator plant Chenopodium amaranticolor, (3) test the effect ofNP on preference and mortality of aphids, and (4) evaluate the potential of NPs to control vector aphids and BCMV-BlC. Bougainvillea leaves were extracted using the maceration method of leaf powder in 96% ethanol and left in the dark for 24 hours at room temperature 25 26?. Then, the ethanol extract of bougainvillea leaves was concentrated using a rotary evaporator until it formed a thick paste. Synthesis of chitosan nanoparticles (Kit-NP), bougainvillea leaf extract (EDB-NP), and their combination (KEDB-NP) using the ionic gelation method with modifications. NP characterization was carried out by observing under a transmission electron microscope (TEM) to determine particle size, scanning electron microscope (SEM) to determine particle morphology, andFourier transform infrared (FTIR) to determine functional groups on NPs. The selection and determination of the best concentration of chitosan and bougainvillea leaf extract, as well as their combination and application time (NP and non-NP), were carried out using bioassay on the indicator plant C. amaranticolor. The application time was carried out before and after 24 hours when the plants were inoculated with BCMV. NP treatments of chitosan, bougainvillea leaf extract, and their combination were tested at concentrations of 100–800 ppm. The parameters observed were the incubation period, the number of local necrotic lesions (LLN), and the relative inhibition level (THR) of LLN formation. Ability of Kit-NP, Kit, EDB-NP, EDB, KEDB-NP, and KEDB on feeding preferences and mortality of aphids Aphis craccivorawas tested using the Choice test withthe three best concentrations from the bioassay results. Plants that have been sprayed with NP are put into insect boxes. All test plants were placed around brown cardboard on the surface of the polybag, in the middle of the cardboard were infested with 25 wingless, virus-free imagesof aphids. The parameters observed were the number of aphids per plant at 1, 3, 6, and 12 hours after infestation (JSI) as well as aphid mortality at 12, 24, and 48 hours after treatment (JSP) and Lethal Concentration 50%(LC50) and 95%(LC95). The ability of Kit-NP, Kit, EDB-NP, EDB, KEDB-NP, and KEDB to control BCMV-BlCinfection in long bean plants was evaluated in greenhouse experiments. The best concentration of NP and non-NP solutions is sprayed on the leaves of plants aged 1 MSTbefore BCMV-BlC inoculation. The parameters observed were incubation period, disease incidence and severity, virus titer, PR3 resistance gene expression, polyphenol oxidase (PPO) enzyme activity, and agronomic parameters. The virus titer is detected serologically, while the PR3 gene is detected by RT-PCR. Kit-NP, EDB-NP, and KEDB-NP were successfully synthesized by a modified ionic gelation method. The average particle sizes of Kit-NP, EDB-NP, and KEDB-NP were 99,72 nm, 163,68 nm, and 221,42 nm, respectively. The morphology of all three is a spherical shape (spherical). KEDB shows wavelength (cm-1) and bonds at 3315 (O–H), 2975 (–CH3), 2832 (–CH3), 2238 (C–I), 2147 (C =C), 2014 (–SCN), 1650 (>N–H), 1392 (–CH3), 1014 (>CH3) and 624 (C–H) which are hydroxyl functional groups, alkanes, organohalogen aliphatic compounds, alkyne, nitrogen, carbonyl and amine. Meanwhile, KEDB-NP shows peak wavelengths (cm-1) and bonds at 3285 (O–H), 2142 (O–H), 1632,8 (>N–H), 689 (C–H), and 592 (C–I) which are hydroxyl functional groups, alkenes, amines, aromatic rings, and organohalogen aliphatic compounds. Spraying C. amaranticolorleaves with Kit-NP, Kit, EDB-NP, EDB, KEDB NP, and KEDB at a concentration of 100–800 ppm before virus inoculation significantly showed a longer incubation period (6 days after inoculation-HSI) compared to treatment after virus inoculation (5 HSI) and the control without treatment (4HSI). NP treatment was able to suppress LLN with a relative level of inhibition ranging from 67%-100% compared to application after virus inoculation. Among the eight concentrations tested, concentrations of 100–300 ppm applied before virus inoculation showed no significantly different effectiveness than higher concentrations in inhibiting LLN formation.However, several treatments after virus inoculation with concentrations > 300 ppm showed high LLN inhibition. Sprayingtreatment with Kit, EDB-NP, EDB, KEDB-NP, and KEDB at 1, 3, and 6 JSIshowed that the number of aphids was not significantly different from the control without treatment. At 12 JSI, plants sprayed with Kit-NP and EDB-NP showed a lower number of aphids compared to the number of aphids on control plants. Mortality of aphids sprayed directly with NP at 12 and 24 JSP was not significantly different from control aphids. However, at 48 JSP, Kit-NP, EDB-NP, and KEDB and non-NP treatments at concentrations of 200 ppm and 300 ppm showed aphid mortality between 40%–66,6% and 54,6%–78,6% which was significantly higher than the control. The LC50 and LC95 at 24 JSP ranged from 427,7-815,5 ppm and 881,5-4019,6 ppm, while at 48 JSP the LC50 and LC95 berkisar 127,8-237,5 ppm and 608,5-1706,7 ppm. Based on the research results, a single treatment of chitosan and bougainvillea leaf extract (NP and non-NP) at a concentration of 100–300 ppm before BCMV BlCinoculation extended the incubation period and reduced disease severity scores (0,8–1,2) compared to disease severity scores of diseased controls without treatment (3,3). Disease symptoms that appear in a single treatment are categorized as mild symptoms (mild mosaic and mild vein clearing). EDB-NP and Kit-NP treatment at a concentration of 300 ppm could significantly reduce the virus titerby 69,4%. Kittreatment was able to induce PR3 gene expression at a concentration of only 100 ppm andas well as inducing the PPO enzyme together with Kit-NP treatment at a higher rate than diseased controls without treatment and other treatments