Peningkatan Frekuensi Metilasi DNA pada Sekuen Karma dan Pertumbuhan Ramet Kelapa Sawit yang Diinokulasi Plant Growth Promoting Bacteria

Abstract

Meningkatnya permintaan global terhadap minyak sawit telah mendorong ketergantungan yang besar pada perbanyakan bibit melalui kultur jaringan (ramet). Proses klonal dengan embriogenesis somatik pada kultur jaringan menyebabkan terbentuknya variasi somaklonal yang erat kaitannya dengan perubahan metilasi DNA. Penurunan metilasi DNA (hipometilasi) khususnya pada sekuen Karma gen EgDEF1 merupakan fenomena epigenetik yang terindikasi sebagai penyebab terjadinya abnormalitas pada organogenesis bunga dan terbentuknya buah mantel sehingga produksi minyak mengalami penurunan. Sampai saat ini, belum ada solusi yang efektif untuk mencegah atau memperbaiki kondisi hipometilasi menjadi normal. Kondisi aseptik pada kultur jaringan merupakan salah satu faktor penyebab menurunnya jumlah bakteri pemacu pertumbuhan tanaman atau plant growth promoting bacteria (PGPB) khususnya pada ramet. Penelitian ini berhipotesis bahwa inokulasi bakteri endofit berpotensi PGPB dapat mengubah ramet yang terhipometilasi menjadi normal. Inokulasi bakteri endofit PGPB diharapkan mencegah terjadinya abnormalitas sejak dini pada pembungaan dan pembentukan buah mantel. Penelitian ini bertujuan untuk: (1) mengidentifikasi isolat bakteri endofit dari ramet dan seedlings kelapa sawit (Elaeis guineensis Jacq.) yang memiliki potensi sebagai plant growth promoting bacteria (PGPB); (2) menganalisis distribusi level metilasi DNA pada sekuen Karma ramet pada awal fase aklimatisasi dan seedlings kelapa sawit; (3) menganalisis pengaruh inokulasi bakteri yang telah diketahui sebagai PGPB terhadap perubahan level metilasi DNA pada sekuen Karma gen EgDEFI serta pertumbuhan ramet kelapa sawit. Penelitian ini dibagi menjadi tiga bagian yaitu pertama adalah melakukan isolasi dan karakterisasi bakteri endofit dari tanaman kelapa sawit yang berasal dari perbanyakan biji atau semai biji yang selanjutnya disebut seedlings dan perbanyakan klonal (ramet) yang berpotensi sebagai pemacu pertumbuhan tanaman. Sebanyak 17 isolat bakteri endofit yaitu 5 isolat (29 %) dari ramet dan 12 isolat (71 %) dari seedlings kelapa sawit berhasil dikultur. Secara umum, karakter PGPB yang dimiliki oleh isolat-isolat tersebut yakni 88% isolat menghasilkan ACC- deaminase, 18 % isolat menunjukkan kemampuan pengikatan nitrogen, 47 % isolat sebagai pelarut fosfat, dan 12 % menghasilkan hormon IAA. Bakteri endofit yang diisolasi dari ramet hanya memiliki kemampuan memproduksi ACC-deaminase dan melarutkan fosfat. Isolat bakteri 3AK yang diisolasi dari akar seedling kelapa sawit memiliki seluruh karakter PGPB yang diujikan pada penelitian ini. Pada pengujian secara in-vitro menggunakan benih padi, inokulasi isolat bakteri 3AK menghasilkan rata-rata panjang tunas (shoots) sebesar 4,4 ± 0,4 cm dan akar (8,2 ± 0,5 cm) paling tinggi dibandingkan dengan kontrol dan seluruh perlakuan. Pengujian pada rumah kaca membuktikan potensi isolat 3AK sebagai pemacu pertumbuhan tanaman dengan bobot kering tunas dan akar seedlings yang tidak berbeda signifikan dengan strain PsJN yang terindikasi sebagai Paraburkholderia phytofirmans (tanaman model dengan kemampuan memacu pertumbuhan tanaman).

Berdasarkan gen 16S rRNA, isolat bakteri 3AK teridentifikasi sebagai Aeromonas taiwanensis yakni Aeromonas taiwanensis strain A2-50 dengan kemiripan 99,69 %. Penemuan isolat bakteri endofit 3AK menjadi sangat menarik karena terkonfirmasi memiliki kemiripan dengan genus Aeromonas yang berasal dari lingkungan. Pada penelitian ini, isolat 3AK teridentifikasi sebagai Aeromonas taiwanensis yang memiliki potensi sebagai PGPB pada seedlings kelapa sawit Pada bagian kedua dilakukan pendeteksian dengan screening level metilasi DNA secara global dan spesifik pada sekuen Karma gen EgDEF1 dari ramet pada awal fase aklimatisasi dan seedlings kelapa sawit. Pengukuran level metilasi DNA sekuen Karma pada ramet dan seedlings menggunakan enzim restriksi sensitif metilasi atau Methylation-Specific Restriction Enzymes (MSREs) yaitu ScrF1 dan Rsa1 untuk pemotongan (digest) dilanjutkan analisis dengan quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR). Pendeteksian metilasi DNA global menggunakan high performance liquid chromatography (HPLC). Hasil penelitian menunjukkan pola distribusi level metilasi DNA pada sekuen Karma ramet (n=161) kelapa sawit lebih menyebar dibandingkan dengan seedlings (n=45) yang cenderung mengelompok atau homogen. Hasil penelitian menunjukkan pola distribusi metilasi DNA sekuen Karma pada ramet dikelompokkan menjadi 3 kategori yaitu hipometilasi (27 %), metilasi sedang (intermediate methylation) (51 %) dan hipermetilasi (22 %), sementara 100% seedlings berada pada level metilasi sedang. Metilasi DNA global pada seedlings kelapa sawit berdasarkan persentase 5-mdCMP yaitu 9,3 ± 1,4 % atau lebih tinggi 24,7 % dibandingkan pada ramet (7 ± 1,3 %). Berdasarkan pengamatan fenotipe, ramet pada kondisi hipometilasi pada sekuen Karma menunjukkan akar yang lebih panjang yaitu 16,2 ± 6,0 cm dibandingkan ramet pada level metilasi normal (intermediate methylation dan hipermetilasi). Pola distribusi metilasi DNA sekuen Karma ramet kelapa sawit yang menyebar terindikasi sebagai salah satu penyebab terbentuknya variasi somaklonal pada kultur jaringan. Inokulasi isolat bakteri endofit mampu mengubah dan memulihkan hipometilasi pada sekuen Karma gen EgDEF1 menjadi metilasi normal dan pengaruhnya terhadap pertumbuhan tanaman menjadi bagian terakhir pada penelitian ini. Ramet kelapa sawit dalam kondisi hipometilasi (n=37) diinokulasi dengan 3 perlakuan yaitu dengan isolat 3AK, isolat PsJN, isolat mix/campuran (3AK, PsJN, R6, dan GS 4.4), dan kontrol (tanpa inokulasi). Hasil penelitian menunjukkan bahwa perubahan paling signifikan hipometilasi sekuen Karma menjadi metilasi normal terjadi pada ramet yang diinokulasi dengan isolat mix/campuran sebesar 62,5 %, sedangkan perlakuan isolat 3AK menunjukkan peningkatan sebesar 44,4 %. Persentase peningkatan level metilasi DNA kedua perlakuan tersebut memperlihatkan hasil yang lebih tinggi dari kontrol (11,1 %). Pertambahan panjang tunas (shoots) dan akar seluruh perlakuan menunjukan hasil yang lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol. Inokulasi 3AK, PsJN dan mix masing-masing menghasilkan rerata pertambahan panjang shoots dan akar berturut- turut 4,0 ± 0,4 cm dan 3,9 ± 1,1 cm; 7,4 ± 1,3 dan 7,3 ± 1,4 cm; serta 5,2 ± 1,4 cm dan 2,9 ± 0,7 cm. Bobot basah seluruh perlakuan juga menunjukan hasil yang lebih tinggi dari kontrol (2,9 ± 0,4 g). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa inokulasi isolat bakteri endofit yang berpotensi sebagai PGPB dapat secara signifikan mengubah sekuen Karma pada gen EgDEF1 yang terhipometilasi menjadi normal

(intermediate methylation dan hipermetilasi) dan meningkatkan pertumbuhan ramet kelapa sawit pada fase aklimatisasi. Berdasarkan uraian di atas, kebaharuan dari penelitian ini: (1) ditemukan isolat bakteri endofit 3AK dari akar seedlings kelapa sawit yang memiliki potensi PGPB dan memiliki kemiripan dengan Aeromonas taiwanensis; (2) diperoleh perbedaan pola distribusi sebaran level metilasi DNA sekuen Karma gen EgDEF1 pada ramet yang menyebar dibandingkan dengan seedlings kelapa sawit yang cenderung mengelompok atau homogen; (3) inokulasi bakteri endofit dapat mengubah level metilasi DNA pada sekuen Karma gen EgDEFI ramet yang terhipometilasi menjadi normal; (4) isolat 3AK yang teridentifikasi Aeromonas taiwanensis pertama kali dilaporkan berpotensi sebagai pemacu pertumbuhan kelapa sawit.

The worldwide surge in palm oil demand has increased reliance on tissue culture for seed propagation (ramets). This clonal somatic embryogenesis process in tissue culture induces somaclonal variations and alterations in DNA methylation. Hypomethylation, particularly in the Karma sequence of the EgDEF1 gene of oil pal ramets, is an epigenetic event that leads to abnormal flower organogenesis and mantled fruits, resulting in reduced oil yield. Currently, no effective method exists yet to prevent or rectify hypomethylation. The aseptic environment in tissue culture reduces plant growth-promoting bacteria (PGPB), especially in ramets. This research proposes that introducing potentially PGPB endophytic bacterial isolates may transform hypomethylated ramets to normal methylation. PGPB inoculation is anticipated to serve as an early prevention of abnormality in flowering and mantled fruits. The objectives of this study are to (1) identify endophytic bacterial isolates from oil palm ramets and seedlings (Elaeis guineensis Jacq.) with potential as plant growth promoting bacteria (PGPB); (2) evaluate DNA methylation levels in oil palm ramets and seedlings at the beginning of the acclimatization phase; (3) examine the impact of bacterial inoculation known as PGPB on DNA methylation level changes in Karma sequence of EgDEF1 gene and the growth of oil palm ramets. This research is divided into three parts; the first is isolating and characterizing endophytic bacteria from oil palm plants, which originate from the propagation of seeds called seedlings and clonal propagation (ramets), which have the potential to stimulate plant growth. A total of 17 isolates of endophytic bacteria, namely 5 isolates (29 %) from ramets and 12 isolates (71 %) from oil palm seedlings, were successfully cultured. In general, the PGPB characters possessed by these isolates are that 88 % of the isolates produce ACC-deaminase, 18 % of the isolates show the ability to fix nitrogen, 47 % of the isolates are phosphate solubilizers, and 12 % produce the hormone IAA. Endophyte bacteria isolated from ramets only possess the capability to produce ACC-deaminase and solubilize phosphate. The 3AK bacterial isolate, isolated from oil palm seedling roots, exhibited all the PGPB characteristics examined in this research. In vitro experiments using rice seeds demonstrated that inoculation with 3AK bacterial isolates yielded the highest average shoot length (4.4 ± 0.4 cm) and root length (8.2 ± 0.5 cm) compared to control and other treatments. In-planta testing confirmed the 3AK isolate's potential as a plant growth promoter, with the dry mass of shoots and roots of seedlings not being significantly different from the PsJN strain, which was indicated as Paraburkholderia phytofirmans (model plant with the ability to stimulate plant growth). Based on 16S rRNA gene analysis, the 3AK bacterial isolate was classified as Aeromonas taiwanensis, specifically Aeromonas taiwanensis strain A2-50, with 99.69 % similarity. Identifying the 3AK bacterial isolate was particularly intriguing due to its resemblance to the environmentally-derived Aeromonas genus. This study

identified the 3AK isolate as Aeromonas taiwanensis, which has the potential as a PGPB for oil palm seedlings. The second part of the study focused on examining global and specific DNA methylation levels in the Karma of EgDEF1 gene of oil palm ramets and seedlings at the beginning of acclimatization. The investigation employed methylation-sensitive restriction enzymes (MSREs), specifically ScrF1 and Rsa1, for digestion, followed by quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) analysis to assess DNA methylation in the Karma sequence. Global DNA methylation was detected using high-performance liquid chromatography (HPLC). Findings revealed a more dispersed distribution pattern of DNA methylation levels in Karma ramet (n=161) sequences compared to the clustered or homogeneous pattern observed in seedlings (n=45) during early acclimatization. The distribution of DNA methylation in Karma sequences was divided into three categories: hypomethylation (27 %), intermediate methylation (51 %), and hypermethylation (22 %), while all seedlings exhibited intermediate methylation levels. Based on the 5-mdCMP percentage, the average global methylation in seedlings was 9.3 ± 1.4 %, exceeding that of ramets (7 ± 1.3 %) by 24.7 %. Phenotypic observations showed hypomethylated ramets had longer roots (16.2 ± 6.0 cm) than those with normal methylation levels. The distribution pattern of DNA methylation in oil palm ramet Karma sequences is suggested as a potential factor contributing to somaclonal variations in tissue culture. Inoculation of endophytic bacterial isolates changed and restored hypomethylation in the Karma sequence of the EgDEF1 gene to normal methylation, and their effect on plant growth was the final part of this research. Oil palm ramets in hypomethylated conditions (n=37) were inoculated with 3 treatments: 3AK isolate, PsJN isolate, mix isolate (3AK, PsJN, R6, and GS 4.4), and control (without inoculation). The results showed that the most significant change in hypomethylation of the Karma sequence to normal methylation occurred in ramets inoculated with the mix isolate at 62.5 %. In comparison, the 3AK isolate treatment showed an increase of 44.4 %. The percentage increase in DNA methylation levels for both treatments showed higher results than the control (11.1%). The increase in the length of shoots and roots in all treatments showed higher yields compared to the control. Inoculation of 3AK, PsJN, and mix each resulted in an average increase in length of shoots and roots of 4.0 ± 0.4 cm and 3.9 ± 1.1 cm; 7.4 ± 1.3 cm and 7.3 ± 1.4 cm and 5.2 ± 1.4 cm and 2.9 ± 0.7 cm. The wet mass of all treatments also showed higher results than the control (2.9 ± 0.4 g). The results of this study indicate that inoculation of endophytic bacterial isolates that have the potential to be PGPB can significantly change the hypomethylated Karma sequence in the EgDEF1 gene to normal (intermediate methylation and hypermethylation) and enhance the growth of oil palm ramets in the acclimatization phase. Based on the description above, the novelties of this research are: (1) 3AK bacterial isolates were found that have PGPB potential from the roots of oil palm seedlings, which are similar to Aeromonas taiwanensis; (2) differences in the distribution patterns of DNA methylation levels of the Karma sequence EgDEF1 gene in ramets were found which are spread out compared to oil palm seedlings which tend to be clustered or homogeneous at the beginning of the acclimatization phase; (3) inoculation of endophytic bacteria alter the hypomethylated Karma sequence in gene EgDEF1 of oil palm ramets to normal methylation; (4) the first reported instance of the 3AK isolate, identified as Aeromonas taiwanensis, showing potential as a growth promoter for oil palm.