Analisis Faktor Genetik yang Mengatur Biosintesis Karotenoid pada Ubi Kayu Varietas Carvita25 (Manihot esculenta Crantz)

Abstract

Karotenoid merupakan senyawa penting pada ubi kayu terutama bagi penduduk yang konsumsi hariannya hanya mengandalkan tanaman ini. Defisiensi provitamin A menjadi masalah kesehatan serius yang mendapat perhatian dunia sehingga banyak upaya biofortifikasi dilakukan dengan tujuan untuk meningkatkan kandungan ß-karoten. Varietas ubi kayu dengan karakter warna umbi kuning mengindikasikan adanya kandungan senyawa karotenoid terutama ß-karoten. Carvita25 merupakan varietas mutan somaklonal berumbi kuning dari Adira4 yang berumbi putih. Biosintesis senyawa ß-karoten dipengaruhi oleh gen fungsional pada jalur karotenoid seperti phytoene synthase (psy), phytoene desaturase (pds), ?-carotene desaturase (zds), ?-carotene isomerase (z-iso), carotenoid isomerase (crtiso), lycopene ?-cyclase (lycE) dan lycopene ß-cyclase (lycB). Akumulasi senyawa karotenoid pada jaringan atau organ spesifik terutama umbi dikendalikan oleh promoter dari gen yang berperan pada jalur biosintesis karotenoid. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mempelajari faktor genetik yang mempengaruhi karakter warna kuning dan akumulasi senyawa karotenoid pada umbi ubi kayu varietas Carvita25 dengan pembandingnya ubi kayu varietas Adira4 berumbi putih. Percobaan pertama penelitian ini bertujuan untuk mempelajari profil kandungan metabolit terutama senyawa ß-karoten dan metabolit lainnya pada umbi Carvita25 dan Adira4 menggunakan metode high-performance liquid chromatography (HPLC) dan liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). Analisis kelimpahan transkrip gen menggunakan metode sekuensing RNA (RNA-seq) pada sampel umbi Carvita25 dan Adira4. Hasil analisis metabolomik menunjukkan adanya senyawa ß-karoten pada umbi Carvita25 sebesar ±22?23 µg/g berat basah yang signifikan tinggi dari umbi Adira4 sebesar <0.02 µg/g berat basah yang menyebabkan perbedaan warna umbi. Senyawa 10'-apo-ß-karotenal (C27H36O) dan 13-apo-ß-karotenon (C18H26O) yang merupakan senyawa turunan dari ß-karoten menjadi apokarotenoid teridentifikasi pada umbi Carvita25 dan tidak pada umbi Adira4. Hasil analisis sekuensing RNA menunjukkan bahwa kelimpahan gen fungsional pada jalur biosintesis karotenoid yaitu transkrip Manes.02G081700.1 atau Manihot esculenta Phytoene synthase 1 (MePSY1) lebih tinggi pada Carvita25 dibandingkan Adira4 sedangkan kelimpahan transkrip Manes.01G124200.4 atau Manihot esculenta Phytoene synthase 2 (MePSY2) lebih rendah signifikan pada Carvita25 dibandingkan Adira4 (p<0.05). Pengayaan gene ontology (GO) menunjukkan adanya gen cytochrome P450 (CYP82D47), phytochrome B (PHYB), dan beberapa faktor transkripsi seperti AP2-like, MYB, keluarga bHLH, subunit TFIID, heat shock factor (HSF), dan beberapa faktor transkripsi lainnya yang kelimpahan transkripnya signifikan lebih tinggi pada Carvita25 dibandingkan Adira4 terlibat dalam proses biologi, komponen seluler dan fungsi molekuler. Percobaan kedua melakukan karakterisasi terhadap struktur dan sekuen gen MePSY1 antara Adira4 dan Carvita25 yang menunjukkan kelimpahan transkrip tinggi pada Carvita25. Sekuen genom lengkap (gMePSY1) dan sekuen mRNA (cMePSY1) antara Adira4 dan Carvita25 menunjukkan adanya perbedaan basa nukleotida. Pada sekuen cds gen MePSY1 Adira4 dan Carvita25 terdapat satu perbedaan basa nukleotida pada posisi basa ke-606 yang menyebabkan perbedaan dalam pengkodean asam amino yaitu asam aspartat pada Adira4 dan asam glutamat pada Carvita25, yang dapat berdampak pada karakteristik produk protein phytoene synthase yang dihasilkan. Sekuen gen MePSY1 Adira4 dan Carvita25 menghasilkan asam amino dengan situs aktif yang terkonservasi. Analisis sekuen gen MePSY1 juga dilakukan pada daerah upstream yaitu 5’untranslated region (UTR) dan daerah promoter yang dilanjutkan pada percobaan ketiga. Percobaan ketiga dilakukan dengan tujuan untuk mempelajari dugaan motif elemen cis-acting (CAE) yang terdapat pada sekuen promoter gen MePSY1 Adira4 dan Carvita25. Hasil analisis menggunakan Plantcare dan PLACE menunjukkan CAE yang berperan pada ekspresi gen spesifik jaringan, motif penting lain seperti respon terhadap cekaman, dan motif yang terlibat dalam aktivasi senyawa karotenoid seperti motif respon terhadap cahaya (light-responsive element /LRE). Pada Carvita25 terdapat motif yang tidak teridentifikasi pada Adira4 yaitu motif AT-1, ACGTTBOX dan SGBFGMGMAUX28. Motif AT-1 merupakan salah satu motif penting pada modulasi ekpresi gen. Promoter gen MePSY1 asal Carvita25 dianalisis lebih lanjut pada percobaan keempat untuk mengetahui fungsi promoter gen MePSY1 pada tanaman model tembakau cv. Petit Havana SR-1. Percobaan keempat dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui fungsi promoter gen MePSY1 asal ubi kayu varietas Carvita25. Dua fragmen promoter gen MePSY1 yaitu P0PSY1 dan P1PSY1 dengan ukuran 2.671 pb dan 1.229 pb telah berhasil disambungkan dengan gen GUS pada vektor biner pCAMBIA.1305.1-GUSplus-tNOS, dan ditransformasikan ke dalam tanaman tembakau. Analisis ekspresi GUS dilakukan terhadap putatif tanaman tembakau transgenik generasi T0 dan T1. Ekspresi gen GUS teramati pada jaringan akar tanaman tembakau putatif transgenik generasi T0 umur 6 bulan yang mampu tumbuh di rumah kaca dengan konstruk promoter P0PSY1sedangkan P1PSY1 teramati espresi gen GUS pada jaringan daun, batang dan akar. Putatif tanaman tembakau generasi T1 belum menunjukkan ekspesi gen GUS pada fase kecambah umur 8 hari. Pola ekspresi gen GUS baru teramati pada kecambah umur 1 bulan pada media MS (Murashige dan Skoog 1962) dengan perlakuan hormon sitokinin BAP di bagian berkas pengangkut daun dan batang, sedangkan pada akar tidak teramati, demikian juga pada perlakuan 50 µM IAA dan ABA teramati pada bagian berkas pengangkut daun dan batang. Promoter P1PSY1 dengan ukuran 1.229 pb masih terdapat motif-motif yang dapat mengekspresikan gen GUS di bagian pembuluh daun dan jaringan vascular/pengangkut. Promoter P1PSY1 mengendalikan ekspresi GUS hanya pada bagian tertentu dan semakin jelas teramati pada waktu tertentu sehingga berfungsi sebagai promoter spasial dan temporal spesifik jaringan atau organ. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa promoter MePSY1 dapat berperan untuk mengendalikan ekspresi gen target secara inducible di organ pembuluh vascular. Informasi variasi basa pada sekuen gen MePSY1 dan promoternya dapat digunakan pada penelitian selanjutnya dengan tujuan perbaikan nutrisi menggunakan teknologi genome editing.

Carotenoids are vital compounds in cassava, particularly for individuals who consume this crop on a daily basis. Provitamin A deficiency is a serious health problem that has received global attention, with numerous biofortification efforts having been undertaken with the aim of increasing the content of ß-carotene. Cassava varieties exhibiting yellow tuber colouration are indicative of the presence of carotenoid compounds, notably ß-carotene. Carvita25 is a somaclonal mutant with yellow-fleshed tubers from Adira4, which has white-fleshed tubers. The formation of ß-carotene compounds is regulated by multiple functional genes in the carotenoid biosynthetic pathway, such as phytoene synthase (psy), phytoene desaturase (pds), Z-carotene isomerase (z -iso), lycopene ?-cyclase (lycE) and lycopene ß-cyclase (lycB). The accumulation of carotenoid compounds in specific tissues or organs, especially cassava tubers, is driven by promoters of genes that play a role in the carotenoid biosynthesis pathway. The aim of this research was to study the factors affecting the yellow colour character and the accumulation of carotenoid compounds in Carvita25 tubers, comparing this to the Adira4, which has white tubers. The primary objective of the present study was to investigate the metabolite profile, with a particular focus on ß-carotene compounds and other metabolites, in Carvita25 and Adira4 tubers. This investigation employed high-performance liquid chromatography (HPLC) and liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS) methods to analyse the metabolite content.Additionally, RNA sequencing (RNA-seq) was utilised to assess the gene transcript abundance in Carvita25 and Adira4 tuber samples. The results of the metabolomic analysis showed the presence of ß-carotene compounds in Carvita25 tubers at ±22-23 µg/g wet weight, which was significantly higher than Adira4 tubers at <0.02 µg/g wet weight, which caused differences in tuber colour. The analysis identified the presence of 10'-apo-ß-carotenal (C27H36O) and 13-apo-ß-carotenone (C18H26O), which are derivative compounds from ß-carotene to apocarotenoids, in Carvita25 tubers but not in Adira4 tubers. Furthermore, RNA sequencing analysis revealed that the abundance of functional genes in the carotenoid biosynthesis pathway, specifically Manes.02G081700.1, also known as Manihot esculenta Phytoene synthase 1 (MePSY1) transcript, was higher in Carvita25. 5 than Adira4, while the abundance of Manes.01G124200.4, or Manihot esculenta Phytoene synthase 2 (MePSY2) transcript, was significantly lower in Carvita25 than Adira4 (p<0.05). Gene ontology (GO) enrichment revealed the presence of cytochrome P450 (CYP82D47), phytochrome B (PHYB), and several transcription factors such as AP2-like, MYB, bHLH family, TFIID subunit, heat shock factor (HSF), and several other transcription factors involved in biological processes, cellular components, and molecular functions. The second experiment examined the structure and sequencing of the MePSY1 gene between Adira4 and Carvita25, revealing a high transcript quantity in Carvita25. Adira4 and Carvita25 have nucleotide variations that affect their whole genomic sequence (gMePSY1) and mRNA sequence (cMePSY1). There is one nucleotide difference at the 606th base position in the cds sequence of the MePSY1 gene, Adira4 and Carvita25, which causes a difference in amino acid encoding, namely aspartic acid in Adira4 and glutamic acid in Carvita25, which can affect the properties of the phytoene synthase protein product produced. The MePSY1 gene sequence in Adira4 and Carvita25 encodes amino acids with conserved active sites. The upstream region, specifically the 5' untranslated region (UTR) and the promoter region, was also analyzed in the third experiment. The third experiment was designed to investigate the putative cis-acting element (CAE) motifs found in the promoter regions of the MePSY1 Adira4 and Carvita25 genes. Plantcare and PLACE analyses revealed CAEs involved in tissue-specific gene expression, as well as other essential motifs like as stress response and light-responsive element (LRE) motifs involved in carotenoid compound activation. Carvita25 has motifs that have not been discovered in Adira4, including the AT-1, ACGTTBOX, and SGBFGMGMAUX28. The AT-1 motif is one of the most important motifs for controlling gene expression. The MePSY1 gene promoter from Carvita25 was further examined in the fourth experiment to evaluate its functions in tobacco model plants cv. Petit Havana SR-1. The fourth experiment aimed to determine the function of the MePSY1 gene promoter from the cassava variety Carvita25. Two promoter fragments of the MePSY1 gene, P0PSY1 and P1PSY1, with sizes of 2,671 pb and 1,229 pb, were successfully spliced with the GUS gene in the binary vector pCAMBIA.1305.1-GUSplus-tNOS and transformed into tobacco plants. GUS expression analysis was performed on putative T0 and T1 generation transgenic tobacco plants. The expression of GUS was detected in the root tissue of 6-month-old T0 generation putative transgenic tobacco plants grown in a greenhouse with the promoter construct P0PSY1, whereas P1PSY1 GUS gene expression was detected in the leaf, stem, and root tissues. At the 8-day-old sprout phase, putative T1 tobacco plants showed no GUS expression. GUS expression patterns were only observed in 1-month-old sprouts on MS media (Murashige and Skoog 1962) with cytokinin hormone BAP treatment in the leaf and stem transport bundles, while the roots were not observed. Additionally, 50 µM IAA and ABA treatment was observed in the leaf and stem transport bundles. The P1PSY1 promoter, with a size of 1,229 pb, was found to be capable of expressing the GUS in leaf vessels and vascular/transporting tissues. The P1PSY1 promoter has been shown to control GUS expression in specific parts of the plant and is more clearly observed at certain times, thus functioning as a tissue- or organ-specific spatial and temporal promoter. The results of this study indicate that the MePSY1 promoter can play a role in the inducible control of target genes in vascular organs. Information pertaining to base variations in the MePSY1 gene sequence and promoter may be utilised in further research to improve nutrition through the application of genome editing technology.