Mikropropagasi Vanda celebica Rolfe pada Media Padat dan Bioreaktor Sistem Perendaman Temporal dengan Penambahan Bahan Organik

Abstract

Vanda celebica Rolfe merupakan anggrek spesies endemik dari Sulawesi Utara yang dilindungi oleh undang-undang. Upaya konservasi V. celebica telah dilakukan oleh Kebun Raya Bogor dengan penyimpanan-kering biji pada suhu rendah. Upaya pendukung konservasi seperti evaluasi daya kecambah biji V. celebica belum dilakukan. Pertumbuhan tunas yang terbatas pada V. celebica karena jenis pertumbuhan batang utama yang monopodial, serta perbanyakan generatif yang sulit dilakukan karena V. celebica adalah spesies endemik yang bergantung pada kondisi ekologi habitat aslinya untuk berbunga menjadi hambatan dalam perbanyakan V. celebica. Upaya perbanyakan untuk mengatasi hambatan tersebut perlu dilakukan untuk mendukung konservasi V. celebica. Mikropropagasi melalui induksi protocorm-like bodies (PLB) dengan penambahan bahan organik sering dilakukan karena efektivitasnya dalam menghasilkan embrio. Regenerasi tunas dari embrio dengan media cair dalam bioreaktor sistem perendaman temporal atau temporary immersion system (TIS) mampu menghasilkan tunas dalam waktu singkat dibandingkan dengan media padat. Mikropropagasi seringkali menghasilkan anakan dengan genetik yang beragam atau memiliki variasi somaklonal yang berbeda dengan tetuanya. Marka molekular yang umum digunakan untuk mendeteksi variasi pada regeneran hasil mikropropagasi diantaranya adalah inter sequence simple repeat (ISSR). Penelitian ini bertujuan 1) memperoleh informasi daya kecambah biji V. celebica yang telah disimpan selama 5 tahun dan komposisi media perkecambahan dan perkembangan yang optimal, 2) memperoleh media dan jenis eksplan protokorm yang optimal untuk perbanyakan PLB V. celebica serta sistem kultur terbaik untuk regenerasi tunasnya, dan 3) memperoleh informasi keragaman genetik dari planlet hasil mikropropagasi V. celebica. Bahan yang digunakan untuk percobaan perkecambahan adalah biji V. celebica yang telah disimpan-kering pada suhu -20 °C selama 5 tahun. Media yang digunakan adalah Knudson C (KC) dengan perlakuan bahan organik 150 ml L-1 air kelapa yang dikombinasikan dengan 40 g L-1 bubur kentang, 40 mL L-1 jus tomat, jus wortel, ekstrak tauge, dan 0.2 g ekstrak ragi. Eksplan untuk induksi PLB berupa beberapa jenis protokorm yang terdiri atas protokorm utuh fase 3 (U-3), protokorm utuh fase 4 (U-4), dan protokorm fase 4 yang diiris (D). Media yang digunakan adalah full-MS dan ½-MS dengan penambahan 150 ml L-1 air kelapa yang dikombinasikan dengan 50 ml L-1 jus tomat, jus wortel, dan ekstrak tauge. PLB clumps digunakan sebagai eksplan untuk optimasi regenerasi tunas dengan TIS. Bioreaktor TIS diatur dengan perendaman selama 2 menit setiap 2 dan 4 jam, dibandingkan dengan media padat dan media cair yang diagitasi dengan shaker. Analisis keragaman genetik dilakukan dengan menguji 19 planlet hasil mikropropagasi (perkecambahan biji, regenerasi langsung dari PLB, regenerasi dari PLB melalui kalus) dan 1 tanaman tetua menggunakan 5 jenis primer ISSR (UBC-811, UBC-818, UBC-825, UBC-827, UBC-857). Biji V. celebica yang telah disimpan-kering selama 5 tahun pada suhu -20 °C berkecambah sebanyak 56-73%. Media yang ditambahkan 40 g L-1 bubur kentang menghasilkan perkembangan biji hingga menjadi tunas terbaik dengan fase 4 sebanyak 9% dan fase 5 sebanyak 3%. Media ½-MS dengan penambahan bahan organik efektif dalam induksi PLB dengan total eksplan terinduksi 18,06-30.56%, dengan setiap eksplan menghasilkan 2,08-3,99 PLB. Penambahan 50 ml L-1 jus tomat, jus wortel, serta ekstrak tauge berpengaruh nyata terhadap persentase PLB hidup. Eksplan protokorm fase 4 yang diiris cenderung memberikan hasil terbaik dengan respon eksplan terinduksi 37,5%, dengan setiap eksplan menghasilkan 4,54 PLB yang terinisiasi setelah 8,18 MST. Sistem TIS memberikan hasil regenerasi tunas terbaik dengan persentase regenerasi tunas 64.84% dengan periode perendaman 2 menit setiap 4 jam dan 37,07% pada TIS dengan periode perendaman 2 menit setiap 2 jam. Planlet hasil mikropropagasi V. celebica beragam dengan koefisien kemiripan 0,67-0,86. Rekonstruksi dendrogram menghasilkan 2 grup pada titik pemotongan 0,67. Grup 1 didominasi oleh planlet hasil perkecambahan biji dan tanaman tetua dengan koefisien kemiripan 0,72-0,86. Grup 2 didominasi oleh planlet hasil induksi PLB dari eksplan protokorm dengan koefisien kemiripan 0,67-0,75. Keragaman genetik dari regeneran hasil mikropropagasi serupa dengan keragaman beberapa spesies Vanda di alam, sehingga dapat mendukung tujuan konservasi.

Vanda celebica Rolfe is an endemic orchid species native to North Sulawesi and protected by law. In order to conserve the V. celebica species, seeds have been dry-stored at low temperatures by the Bogor Botanical Garden. The evaluation of the germination of V. celebica seeds, a necessary component of conservation efforts, has yet to be carried out. The limited shoot growth observed in V. celebica is attributed to its monopodial type of main stem growth. Additionally, the difficulty in achieving generative propagation is a consequence of V. celebica being an endemic species that is dependent on the ecological conditions of its natural habitat for flowering. These factors collectively present significant challenges in propagating V. celebica. It is imperative that propagation efforts be undertaken to support the conservation of V. celebica. The induction of protocorm-like bodies (PLB) through the addition of organic compounds is a common micropropagation technique due to its efficacy in producing embryos. The regeneration of shoots from embryos using liquid media in a temporary immersion system (TIS) bioreactor has been demonstrated to be a relatively efficient method, compared to solid media. Micropropagation often produces seedlings with diverse genetics or somaclonal variations that differ from their parents. The most commonly used molecular markers for the detection of variations in micropropagated regenerants are inter-sequence simple repeats (ISSR). The objective of this study were to 1) 1) obtain information on the germination of V. celebica seeds that have been stored for 5 years and the optimal composition of germination and development media, 2) obtain the optimal media and type of protocorm explants for PLB propagation of V. celebica and the best culture system for shoots regeneration, and 3) obtain information on the genetic diversity of V. celebica micropropagated planlets. The materials used for germination experiments were V. celebica seeds that had been stored-dried at -20°C for 5 years. The medium used was Knudson C (KC) with organic compound treatments comprising 150 mL L-1 coconut water, combined with 40 g L-1 potato puree, 40 mL L-1 tomato juice, carrot juice, bean sprout extract, and 0.2 g yeast extract. Explants used for PLB induction were whole protocorm stage 3 (U-3), whole protocorm stage 4 (U-4), and divided protocorm stage 4 (D). The media employed were full-MS and ½-MS with the addition of 150 ml L-1 coconut water combined with 50 ml L-1 tomato juice, carrot juice, and bean sprout extract. PLB clumps were used as explants for optimisation of shoot maturation with TIS. The TIS bioreactor was adjusted by two immersion periods for 2 min every 2 and 4 h, compared with solid media and liquid media that was agitated with a shaker. Genetic analysis was conducted by testing 19 micropropagated planlets (seed germination, direct regeneration from PLB, regeneration from PLB through callus) and 1 parental plant using 5 types of ISSR primers (UBC-811, UBC-818, UBC-825, UBC-827, UBC-857). Seeds of V. celebica that had been stored at -20°C for a period of five years demonstrated a germination rate of between 56 and 73%. The addition of potato puree to the medium resulted in the most optimal development of seeds into shoots, with stage 4 reaching a frequency of 9% and stage 5 reaching a frequency of 3%. The media consisted of ½-MS supplemented with organic compounds was found to be an effective method for PLB induction, resulting in a total of 18,06-30,56% induced explants. Each explant produced 2.08-399 PLBs. The addition of 50 ml L-1 tomato juice, carrot juice, and bean sprout extract had a significant effect on the percentage of survived PLB. The divided protocorm stage 4 resulted in a considerably optimal outcome, exhibiting 37,5% induced explant, yielding 4,54 PLB per explant, occuring after 8,18 weeks. The TIS system has been observed to yield the most optimal results in terms of shoot regeneration, with a shoot maturation percentage of 64,84% with an immersion time of two minutes every four hours and 37,07% with an immersion time of two minutes every two hours. The planlets resulting from micropropagation of V. celebica exhibited considerable diversity, with a similarity coefficient ranging from 0,67 to 0,86. The dendrogram reconstruction yielded two groups at 0,67. Group 1 was dominated by planlets derived from seed germination and parental plants, with a similarity coefficient ranging from 0.72 to 0.86. Group 2 was dominated by planlets resulting from PLB induction from protocorm explants, with a similarity coefficient of 0,67–0,75. The results demonstrate that the genetic diversity observed within regenerants was comparable to that observed in natural populations, which provides support for conservation of Vanda celebica.