Aktivitas Antigenotoksik Eugenol di Tingkat Seluler: Studi pada Khamir Schizosaccharomyces pombe

Abstract

Genotoksin merupakan agen senyawa yang dapat merusak materi genetik sel (RNA dan DNA) sehingga menyebabkan mutasi genetik. Paparan senyawa genotoksin dapat memicu akumulasi radikal bebas berupa molekul Reactive Oxygen Species (ROS) seluler. Produksi ROS seluler dan paparan ROS dari lingkungan yang berlebih mengakibatkan kerusakan pada struktur dan fungsi DNA. Kerusakan DNA dapat menyebabkan kelainan struktur kromosom yang diikuti dengan kesalahan dalam replikasi DNA. Paparan senyawa genotoksin pada sistem seluler tubuh manusia dapat berdampak negatif pada fungsi DNA yang dapat memicu terjadinya penyakit degeneratif. Strategi yang efektif untuk menanggulangi toksisitas ROS adalah aplikasi senyawa dengan aktivitas antioksidan. Senyawa tersebut diketahui mampu berinteraksi dengan radikal bebas sehingga dapat menghentikan reaksi berantai dari ROS sebelum merusak sel dengan menginduksi reaksi molekuler resistensi terhadap cekaman oksidatif. Salah satu tanaman yang menjadi sumber antioksidan alami adalah cengkeh (Syzygium aromaticum). Eugenol merupakan senyawa bioaktif alami yang menjadi penyusun utama minyak bunga dan daun cengkeh. Eugenol diketahui memiliki beragam bioaktivitas seperti antioksidan, antiinflamasi, antitumor, dan antimikroba. Penelitian terkait aktivitas antigenotoksik dari eugenol asal cengkeh (S. aromaticum) belum banyak dilakukan. Penelitian ini bertujuan menentukan aktivitas antigenotoksik senyawa bioaktif eugenol asal cengkeh (S. aromaticum) di level seluler dan molekuler dengan analisis transkriptomik pada khamir Schizosaccharomyces pombe sebagai organisme model. Penelitian ini diawali dengan menguji aktivitas antioksidan dari eugenol secara in vitro menggunakan radikal 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). Eugenol kemudian diuji efek antigenotoksiknya pada organisme model khamir S. pombe. Uji antigenotoksik pada khamir ini dilakukan dengan memberikan perlakuan genotoksik berupa paparan sinar ultraviolet (UV) dan senyawa Ethyl methanesulfonate (EMS) dengan konsentrasi tertentu. Efek antigenotoksik dari eugenol diamati dari viabilitas sel S. pombe setelah diberi paparan genotoksin tersebut. Efek antigenotoksik dari eugenol kembali diuji secara in vitro menggunakan metode DNA Nicking Assay. Uji tersebut dilakukan menggunakan materi genetik berupa plasmid pBR322 yang diinduksi gentoksik berupa reagen fenton dan diberi perlakuan eugenol. Efek antigenotoksik dari eugenol selanjutnya dianalisis secara transkriptomik pada sel khamir S. pombe dengan metode Principal Component Analysis dan Heatmap. Analisis ini dilakukan berdasarkan respons dari sel khamir tersebut terhadap cekaman oksidatif dan perbedaan pola transkriptomik akibat pengaruh perlakuan eugenol. Hasil penelitian menunjukkan bahwa eugenol memiliki aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 sebesar 26 ± 0,4 µg. mL-1 yang termasuk kelompok antioksidan yang sangat kuat. Aktivitas antioksidan yang sangat kuat ini dapat menangkal efek dari radikal bebas karena senyawa tersebut dapat mendonorkan atom hidrogen melalui mekanisme transfer elektron. Pengamatan viabilitas sel S. pombe setelah diberi perlakuan agen gentoksin berupa UV dan EMS menunjukkan bahwa penambahan eugenol pada konsentrasi 10, 20, dan 40 µg/mL ke dalam kultur dapat meningkatkan viabilitas sel S. pombe. Viabilitas sel khamir tersebut meningkat sebanyak 1,94 kali lipat dibandingkan dengan kontrol pada jam ke-0 (2×106 ± 5,94 ×105 CFU.mL-1) dan 3,20 kali lipat dibandingkan kontrol pada jam ke-12 (2,5×106 ± 8,6 ×106 CFU.mL-1) setelah perlakuan UV, dan meningkat sebanyak 4,2 kali lipat dan 3,4 kali lipat dibandingkan kontrol (1,3×106 ± 4,2 ×104 CFU. mL-1)setelah diberi perlakuan EMS pada konsentrasi 0,25 dan 0,5%. Hasil uji antigenotoksik berdasarkan metode DNA nicking assay menunjukkan bahwa perlakuan eugenol pada konsentrasi 40 µg.mL-1 mampu menjaga stabilitas struktur plasmid uji ditunjukkan dengan dengan ketebalan pita hasil elektroforesis yang lebih tebal dibandingkan dengan kontrol atau konsentrasi eugenol yang lain. Perbedaan konsentrasi DNA ini dipengaruhi oleh kemampuan berbagai konsentrasi eugenol dalam menetralisir toksisitas reagen yang digunakan. Hasil analisis PCA berdasarkan ontologi gen berhasil mengelompokkan gen-gen terkait mekanisme perbaikan DNA (DNA damage repair) yang menurun (down) dan meningkat (up) ekspresinya terhadap pemberian eugenol. Eugenol dapat meregulasi berbagai ekspresi gen yang berkaitan dengan peningkatan kemampuan S. pombe dalam mengurangi dampak kerusakan DNA akibat paparan ROS di lingkungan. Perubahan ekspresi gen berkaitan dengan tiga respon meliputi DNA mismatch repair, base excision repair dan nucleotide excision repair. Hasil analisis PCA dan Heatmap menunjukkan perlakuan eugenol dapat memengaruhi ekspresi gen terkait DNA Damage Response antara lain gen exo1, mlh1, dpb2, rad16, dan tfb1. Gen yang terekspresi tersebut berkaitan dengan memperbaiki kesalahan pencocokan DNA pada proses replikasi DNA, menjaga kestabilan genom, dan memperbaiki kerusakan DNA.