Infektivitas Virus dan Tingkat Transkripsi Gen pif Spodoptera litura Nucleopolyhedrovirus (SpltNPV) Isolat Bogor

Abstract

Ulat grayak (Spodoptera litura) merupakan salah satu spesies hama penting yang menyerang banyak jenis komoditas pertanian di Indonesia, antara lain tembakau, kacang tanah, kedelai, talas, dan cabai. Pengendalian ulat grayak dapat dilakukan secara biologis melalui pemanfaatan entomopatogen berupa Nucleopolyhedrovirus. Karakter morfologi dan fisiologi dari NPV dikendalikan oleh informasi genetik yang terdapat di dalam genom virus. Gen per os infectivity factor (pif) merupakan salah satu gen yang berperan dalam proses infeksi virus pada sel epitel usus halus inang. Informasi lengkap mengenai gen pif NPV perlu dilakukan untuk mempelajari faktor virulensi virus yang diperlukan sebagai acuan dalam aplikasi pengendalian hayati hama. Penelitian ini bertujuan menguji infektivitas isolat, memperoleh informasi karakter genetik, dan tingkat transkripsi gen pif dari SpltNPV asal Bogor. Pengujian infektivitas isolat SpltNPV dilakukan dengan menginokulasikan virus pada lima konsentrasi yang berbeda (1×105, 5×105, 1×106, 5×106, 1×107 POBs/ml) ke larva instar ke-3 pada pakan buatan. Karakterisasi genetik dari tiga gen pif, yakni pif-1, pif-2, dan pif-3 dilakukan dengan mengamplifikasi sampel DNA dari larva yang terinfeksi NPV menggunakan primer spesifik. Produk PCR disekuensing kemudian sekuens DNA dianalisis dengan program BioEdit, BLAST, MEGA, dan Expasy untuk memperoleh informasi homologi, filogeni, dan struktur asam amino dari SpltNPV isolat Bogor. Pengamatan tingkat transkripsi gen pif dilakukan dengan menginokulasi virus dengan konsentrasi 1×106 POBs/ml pada larva instar ke-3, kemudian mengamplifikasi sampel RNA dari ulat terinfeksi menggunakan teknik Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR (RT-qPCR). Data amplifikasi dari qPCR kemudian diolah berdasarkan metode relative quantification untuk memperoleh nilai ekspresi relatif dari gen pif-1. Hasil uji infektivitas SpltNPV Bogor menunjukkan bahwa konsentrasi tertinggi 1×107 POBs/ml dan terendah 1×105 POBs/ml mengakibatkan mortalitas larva S. litura berturut-turut sebesar 100 dan 73,3 % pada 14 hari setelah inokulasi (HSI). Analisis probit menunjukkan nilai LD50 dan LT50 terbaik secara berturut-turut sebesar 8,45 × 104 POBs/ml dan 5,38 hari. Berdasarkan hasil analisis sekuens, gen pif-1, pif-2, dan pif-3 dari isolat Bogor memiliki nilai persentase kemiripan paling tinggi secara berturut-turut sebesar 99,56%, 99,37% dan 100% jika dibandingkan dengan isolat SpltNPV KY dan T0 asal Cina. Analisis homologi dan filogeni menunjukkan SpltNPV asal Bogor memiliki kekerabatan paling tinggi dengan isolat SpltNPV asal Cina dan Jepang. Hasil analisis tingkat transkripsi menunjukkan bahwa gen pif-1 pada SpltNPV Bogor mengalami peningkatan ekspresi pada 49 dan 72 jam setelah inokulasi yang ditandai dengan nilai ekspresi relatif secara berturut-turut sebesar 24,32 dan 28,13 dalam logaritma berbasis 2.

Tobacco cutworm (Spodoptera litura) is an important pest species that attacks many types of agricultural commodities in Indonesia, including tobacco, peanuts, soybeans, taro, and chili. Control of armyworms can be done biologically through the utilization of entomopathogens in the form of Nucleopolyhedrovirus. The morphological and physiological characters of NPV are controlled by genetic information contained in the viral genome. The per os infectivity factor (pif) gene is one of the genes that plays a role in the process of viral infection of host small intestinal epithelial cells. Complete information on the NPV pif gene is necessary to study the virulence factor of the virus which is needed as a reference in pest biological control applications. This study aims to test the infectivity of isolates, obtain information on genetic characters, and transcription levels of the pif gene of SpltNPV from Bogor. Infectivity testing of SpltNPV isolates was conducted by inoculating five different virus concentrations (1×105, 5×105, 1×106, 5×106, 1×107 POBs/ml) in third instar larvae on artificial feed. Genetic characterization of the three pif genes, pif-1, pif-2, and pif-3, was performed by amplifying DNA samples from NPV-infected larvae using specific primers. PCR products were sequenced, and DNA sequences were analyzed with BioEdit, BLAST, MEGA, and Expasy programs to obtain information on homology, phylogeny, and amino acid structure of SpltNPV Bogor isolates. Observation of the transcription level of the pif gene was carried out by inoculating the virus with a concentration of 1×106 POBs/ml in third instar larvae, then amplifying RNA samples from infected caterpillars using the Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR (RT-qPCR). Amplification data from qPCR was then processed based on the relative quantification method to obtain the relative expression value of the pif-1 gene. The infectivity test results of SpltNPV Bogor showed that the highest concentration of 1×107 POBs/ml and the lowest concentration of 1×105 POBs/ml resulted in mortality of S. litura larvae of 100 and 73,3%, respectively, at 14 days post inoculation (DPI). Probit analysis showed the best LD50 and LT50 values of 8,45 × 104 POBs/ml and 5,38 days, respectively. Based on the results of sequence analysis, the pif-1, pif-2, and pif-3 genes from the Bogor isolate had the highest similarity percentage values of 99,56%, 99,37% and 100%, respectively, when compared to SpltNPV KY and T0 isolates from China. Homology and phylogeny analysis showed that SpltNPV from Bogor had the highest kinship with SpltNPV isolates from China and Japan. Transcription level analysis showed that the pif-1 gene in Bogor SpltNPV had increased expression at 49 and 72 hours after inoculation, characterized by relative expression values of 24,32 and 28,13 in log2, respectively.