Deteksi Mycobacterium abscessus Complex (MABC) pada Macaca fascicularis serta Karakterisasi Molekular kandidat Gen Spesifik Uji TB Primata

Abstract

Mycobacterium abscessus Complex (MABC) merupakan kelompok mycobacteria yang berhubungan dengan penyakit infeksi pada paru selain tuberkulosis (TB). Hewan primata, khususnya Macaca fascicularis berpotensi menjadi inang infeksi dan menjadi hal yang penting dalam pelaksanaan deteksi serta penanggulangan infeksi. Penggunaan Mamalian Old Tuberculin (MOT) untuk deteksi tuberkolosis pada primata hingga saat ini masih memiliki kendala baik pada sensitivitas uji, prosedur yang rumit, hingga biaya yang mahal. Pengembangan kit deteksi TB dengan sensitivitas lebih baik secara mandiri kemudian penting untuk mendorong pendeteksian TB yang lebih mudah dan akurat. Salah satu target gen yang memiliki potensi untuk mendeteksi dan membedakan infeksi mycobacterium adalah gen Rv1984c dan Rv2626c. Kedua gen ini diduga memiliki kemampuan dalam peningkatan respon imun dan dapat dimanfaatkan dalam target deteksi berbasis antigen-antibodi. Penelitian ini bertujuan mengeksplorasi adanya infeksi mycobacterium melalui amplifikasi heat shock protein-65 (hsp65) pada berbagai koleksi spesimen primata kemudian mengkarakterisasi protein Rv1984c dan Rv2626c sebagai kandidat gen potensial pengembangan uji TB primata. Penelitian ini diawali dengan ekstraksi DNA sampel asal broncoalveolar lavage, oropharyngeal swab dan nasopharyngeal swab dari Macaca fascicularis. Deteksi molekular TB dengan target gen hsp65 berhasil mengidentifikasi adanya indikasi infeksi MABC yang dikonfirmasi melalui metode PCR. Sebanyak 9 dari 19 sampel menunjukkan hasil positif dan dilakukan analisis sekuensing. Hasil BLASTn sekuensing mengarah pada hsp65 kelompok bakteri Mycobacterium abscessus (Mab) yang selanjutnya dilakukan pembentukan pohon filogenetik dilengkapi dengan hsp65 kelompok mycobacterium. Hasil amplifikasi sampel positif kemudian dilanjutkan untuk karakterisasi protein Rv1984c dan Rv2626c serta membandingkan sekuen yang diperoleh terhadap sekuen dari Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Karakterisasi yang dilakukan meliputi penyejajaran sekuen, pembentukan prediksi struktur tiga dimensi (3D) protein dan analisis epitop melalui imunoinformatika. Hasil penyejajaran sekuen menunjukkan Rv1984c_Mab yang tergolong pada kelompok protein mirip cutinase menunjukkan kemiripan dengan Rv1984_Mtb sebesar 50,72%; RMSD=0,490 Å. Kemiripan lebih rendah didapati pada Rv2626c yaitu sebesar 27,27%; RMSD=9,206 Å. Prediksi struktur 3D protein dan permukaan epitop protein menunjukkan Rv1984c_Mtb tidak jauh berbeda dengan Rv1984c_Mab. Kemiripan motif pelipatan protein antara Rv1984c_Mab dan Rv1984c_Mtb juga diprediksi menjadi alasan aktivitas imunogenik oleh Rv1984c. Eksplorasi awal dan karakterisasi molekular yang dilakukan ini menegaskan dasar informasi yang terarah bagi tahapan penelitian berikutnya untuk pengembangan kit deteksi TB ataupun kandidat multi-epitop vaksin.

Mycobacterium abscessus Complex (MABC) is a group of non-tuberculosis mycobacteria that are associated with pulmonary diseases other than tuberculosis (TB). Primates, especially Macaca fascicularis, have potential to be a host transmission and its becomes important to detect and examine the infections. The use of Mammalian Old Tuberculin (MOT) for TB detection still has problems such as lack of sensitivity, complex procedures, also high-cost procurement. Therefore, the development of detection tools with better sensitivity independently is crucial to enhance accurate detection. The target genes that have the potential to detect and differentiate mycobacterium infection are Rv1984c and Rv2626c. These two genes are scientifically explored to increase immune responses and are utilized as antigen-antibody based detection targets. Our research aims to detect mycobacterium infection through amplification of heat shock protein-65 (hsp65) in different sample collections from captive primates, then characterize the Rv1984c and Rv2626c proteins as potential candidate genes to detect TB in primates. The first step of this research is extracting DNA from bronchoalveolar lavage, oropharyngeal swab and nasopharyngeal swab of Macaca fascicularis. Molecular detection using hsp65 target gene successfully identified the indicated infection of MABC, confirmed by the conventional PCR method. A total of 9 out of 19 sample tests indicated positive results and were then nucleotide sequenced. The BLASTn hit was close to Mycobacterium abscessus (Mab), then a phylogenetic tree was constructed aligned with hsp65 gene from mycobacterium. This research further analyzed to characterize the Rv1984c and Rv2626c protein of Mycobacterium abscessus (Mab) compared with the Mycobacterium tuberculosis (Mtb) sequence based on bioinformatics analysis. Characterization protein included sequence alignment, 3D structure protein prediction, and epitope analysis using immunoinformatics. As alignment result indicated that Rv1984c_Mab which belongs to the cutinase-like proteins family shows 50,72% similarity with Rv1984c_Mtb (RMSD=0,490 Å). Lower similarity was obtained in Rv2626c (27,27% similarity; RMSD=9,206 Å). The 3D protein models and epitope surface prediction showed similarities between Rv1984c_Mtb and Rv1984c_Mab. The similarities of epitope surface were also predicted to be a reason of Rv1984c immunogenic activity. This preliminary research exploration and molecular characterization confirm the basic needs for directional information to the next research stages such as developing TB detection kit or multi-epitope vaccine candidate.