Analisis Keragaman Genetik Durian Kura-kura (Durio testudinarius Becc.) Berdasarkan Marka Morfologi, DNA Barcoding dan Simple Sequence Repeat

Abstract

Durian Kura-kura (Durio testudinarius Becc.) merupakan spesies endemik Kalimantan dari famili Malvaceae yang memiliki karakter yang unik dan berbeda dari kerabat durian pada umumnya, yaitu buah muncul pada pangkal batang utama. Karakter ini merupakan sumber genetik yang berpotensi untuk dimanfaatkan dalam perakitan varietas unggul melalui program pemuliaan tanaman. Sedikitnya informasi dan kajian tentang keragaman genetik jenis ini berdampak pada kegiatan konservasi dan pemanfaatan plasma nutfah melalui program pemuliaan tanaman tidak berjalan dengan optimal. Tujuan umum penelitian ini adalah untuk mengkarakterisasi dan menganalisis keragaman genetik Durian Kura-kura berdasarkan pendekatan morfologi dan molekuler menggunakan DNA barcoding dan marka simple sequence repeat (SSR). Penelitian ini terdiri atas tiga topik dan empat percobaan. Topik pertama (percobaan pertama) yaitu menganalisis keragaman genetik D. testudinarius menggunakan pendekatan karakter morfologi. Percobaan ini menggunakan 50 aksesi dari lima populasi di Kalimantan Barat yaitu Sambas, Landak, Sanggau, Sekadau dan Ketapang. Sebanyak 15 parameter morfologi vegetatif digunakan dalam parameter pada percobaan ini. Dari total parameter uji, sebanyak sembilan parameter menunjukkan keragaman di antara aksesi uji. Karakter tersebut yaitu panjang dan lebar helai daun, rasio panjang-lebar helai daun, permukaan batang, bentuk helaian daun, bentuk ujung dan pangkal daun, tepi helaian daun dan kekilauan permukaan bawah daun. Berdasarkan analisis klaster dengan metode Ward, aksesi-aksesi uji memperlihatkan mengumpul berdasarkan populasi asal masing-masing dan mengelompok menjadi dua grup utama, yaitu grup yang terdiri dari populasi Sekadau, Landak dan Sanggau, dan grup yang terdiri dari populasi Sambas dan Ketapang. Pengelompokkan ini mengindikasikan adanya kemiripan di antara populasi uji. Topik kedua (percobaan kedua) yaitu menganalisis keragaman genetik D. testudinarius menggunakan DNA barcoding. Sebanyak satu sampel dari masing-masing populasi dilakukan pengurutan DNA berdasarkan marka DNA barcoding dari tiga gen kloroplas yaitu rbcL, matK dan trnL-trnF intergenic spacer serta satu wilayah inti internal transcribed spacer (ITS). Hasil analisis variasi nukleotida menunjukkan adanya variasi yang rendah dari lima aksesi uji pada tiga gen kloroplas, namun menunjukkan variasi yang tinggi pada wilayah inti ITS. Hal ini membuktikan bahwa genom kloroplas memiliki laju evolusi yang rendah dibandingkan dengan genom inti. Laju evolusi genom kloroplas dan inti berbeda secara signifikan karena beberapa faktor dalam dan luar, termasuk cara pewarisan, laju mutasi, dan tekanan evolusi yang dihadapi. Analisis filogenetik menunjukkan pengelompokkan kelima aksesi di satu grup yang sama baik berdasarkan gen kloroplas maupun wilayah inti ITS. Secara umum kelima aksesi memperlihatkan hubungan kekerabatan yang dekat dengan D. beccarianus, terlihat dari jarak genetik antar keduanya pada pohon filogenetik. Topik ketiga (percobaan tiga dan empat) yaitu mengembangkan marka SSR spesifik dan menggunakannya dalam analisis keragaman genetik populasi D. testudinarius. Percobaan ketiga menggunakan data pengurutan genom utuh (whole genome sequencing/WGS) dari genom D. testudinarius hasil teknologi next generation sequencing (NGS). Penggalian data SSR menggunakan program MISA dan desain primer memanfaatkan perangkat lunak Primer3 berbasis internet. Sebanyak 20 pasang primer berhasil didesain dan teramplifikasi dengan baik pada sampel DNA genom D. testudinarius. Kedua puluh pasang primer baru ini juga diuji dan dapat teramplifikasi pada 19 sampel DNA genom spesies lainnya dari anggota ordo Malvales. Hal ini menunjukkan kedua puluh pasang primer yang baru ini memiliki tingkat transferabilitas yang luas, terutama pada anggota Malvaceae. Percobaan keempat menggunakan marka SSR spesifik yang telah didesain pada percobaan ketiga untuk menganalisis keragaman genetik pada lima populasi D. testudinarius. Pengamatan alel dari semua lokus menggunakan metode capillary electrophoresis dan data dianalisis menggunakan perangkat lunak GenAlEx 6.5. Hasil analisis pada percobaan keempat menunjukkan sebanyak 19 dari total 20 primer yang diuji memperlihatkan bentuk polimorfis. Secara umum, kedua puluh lokus menghasilkan 84 alel di 20 aksesi uji, dengan rata-rata 4,2 alel per lokus. Di antara primer yang diuji, sebanyak sembilan primer yaitu P1, P2, P4, P7, P8, P13, P14, P16, dan P17 digolongkan sebagai marka yang sangat informatif (PIC > 0,5), sebanyak empat primer yaitu P3, P10, P11 dan P15 (0,25 > PIC > 0,5) merupakan marka yang cukup informatif, dan tujuh primer lainnya yaitu P5, P6, P9, P12, P18, P19, dan P20 dikategorikan marka yang kurang informatif (PIC < 0,25). Nilai heterozigositas amatan dan nilai heterozigositas harapan dari rata-rata semua populasi masing-masing adalah 0,263 dan 0,268. Berdasarkan jumlah alel dan nilai heterozigositas, populasi Sekadau memiliki keragaman genetik yang tertinggi dibandingkan dengan keempat populasi lainnya dengan jumlah alel sebanyak 2,8 alel per lokus dan nilai heterozigositas amatan (Ho) dan heterozigositas harapan (He) rata-rata sebesar masing-masing 0,363 dan 0,453. Namun demikian, populasi Sekadau memperlihatkan rata-rata alel yang teramati dominan dalam bentuk homozigot (Ho < He). Nilai polimorphic infomation content (PIC) berkisar antara 0,049 hingga 0,869 dengan rata-rata 0,454. Berdasarkan analisis ragam molekuler menunjukkan porsi keragaman di dalam dan antar populasi D. testudinarius relatif seimbang, masing-masing sebesar 54 dan 46%. Analisis klaster menggunakan marka SSR menghasilkan dendrogram yang menunjukkan bahwa populasi Landak, Sekadau, dan Sanggau mengelompok pada grup yang sama, sedangkan populasi Sambas dan Ketapang cenderung membentuk kelompok yang berbeda.

Durian Kura-kura (Durio testudinarius Becc.) is an endemic Kalimantan species from the Malvaceae family with a unique character that is different from its durian relatives in general, namely that the fruit appears at the base of the main stem. Plant breeding programs can potentially utilize this character as a genetic resource to develop superior varieties. The lack of information and studies about this type of genetic diversity has an impact on conservation activities and the use of germplasm in plant breeding programs, which are not running optimally. The general aim of this research is to characterize and analyze the genetic diversity of Durian Kura-kura based on morphological and molecular approaches using DNA barcoding and simple sequence repeat (SSR) markers. This research consists of three topics and four experiments. The first topic (the first experiment) was analyzing the genetic diversity of D. testudinarius using a morphological character approach. This experiment used 50 accessions from five populations in West Kalimantan, namely Sambas, Landak, Sanggau, Sekadau, and Ketapang. This experiment employed a total of 15 vegetative morphology parameters. Out of the total test parameters, nine showed variation among the test accessions. These characters include leaf length and width, leaf length-to-width ratio, trunk surface, leaf blade shape, leaf apex and base shape, leaf blade maragin, and leaf lower surface glossiness. Based on cluster analysis using the Ward method, the test accessions showed that they clustered based on their respective populations and were grouped into two main groups, namely the group consisting of the Sekadau, Landak, and Sanggau populations and the group consisting of the Sambas and Ketapang populations. This grouping indicates that there are similarities between the test populations. The second topic (the second experiment) was analyzing the genetic diversity of D. testudinarius using DNA barcoding. A sample from each population was used for DNA sequencing using markers from three chloroplast genes (rbcL, matK, and trnL-trnF intergenic spacers) and one nuclear region of the internal transcribed spacer (ITS). The nucleotide variation analysis results showed that there was low variation in the five test accessions in the three chloroplast genes, but high variation in the ITS region. This proves that the chloroplast genome has a low evolutionary rate compared to the nuclear genome. The rates of evolution of chloroplast and nuclear genomes differ significantly due to several internal and external factors, including mode of inheritance, mutation rate, and evolutionary pressures. Phylogenetic analysis revealed that the five accessions were grouped together based on chloroplast genes and the ITS region. In general, the five accessions show a close relationship with D. beccarianus, as seen from the genetic distance between the two on the phylogenetic tree. The third topic (experiments three and four) involved developing specific SSR markers and using them in the genetic diversity analysis of the D. testudinarius population. The third experiment used whole genome sequencing (WGS) data from the D. testudinarius genome produced by next-generation sequencing (NGS) technology. SSR data mining was performed using the MISA program, and primer design was done using the internet-based Primer3 software. A total of 20 pairs of primers were successfully designed and amplified well in D. testudinarius genomic DNA samples. These twenty pairs of new primers were also tested and could be amplified in 19 genomic DNA samples from other species in the Malvales order. This shows that these twenty new pairs of primers have a wide level of transferability, especially to members of the Malvaceae. The fourth experiment analyzed genetic diversity in five populations of D. testudinarius using specific SSR markers designed in the third experiment. The capillary electrophoresis method was used to observe alleles from all loci, and GenAlEx 6.5 software was used for data analysis. The analysis results for the fourth experiment showed that 19 of the total 20 primers tested had polymorphic forms. In general, the twenty loci produced 84 alleles in the 20 test accessions, with an average of 4.2 alleles per locus. Polymorphic information content (PIC) values ranged from 0.049 to 0.869, with an average of 0.454. Among the primers tested, nine primers, namely P1, P2, P4, P7, P8, P13, P14, P16, and P17, were classified as highly informative markers (PIC > 0.5); four primers, namely P3, P10, P11, and P15 (0.25 > PIC > 0.5), are quite informative markers; and the other seven primers, namely P5, P6, P9, P12, P18, P19, and P20, are categorized as less informative markers (PIC < 0.25). The observed and expected heterozygosity values of the average of all populations are 0.263 and 0.268, respectively. Based on the number of alleles and heterozygosity values, the Sekadau population has the highest genetic diversity compared to the other four populations, with a total of 2.8 alleles per locus and an average observed heterozygosity (Ho) and expected heterozygosity (He) value of 0.363 each and 0.453, respectively. However, the Sekadau population had an average of alleles that were observed to be dominant in homozygous form (Ho < He). According to molecular variance analysis, the diversity within and between D. testudinarius populations is relatively balanced, at 54 and 46%, respectively. Cluster analysis using SSR markers produced a dendrogram showing that the Landak, Sekadau, and Sanggau populations clustered in the same group, while the Sambas and Ketapang populations tended to form different groups.