Depolimerisasi Pektin Kulit Durian: Kajian Aktivitas Antibakteri dan Profil Nuclear Magnetic Resonance (NMR)

Abstract

Konsumsi buah durian yang tinggi di negara-negara Asia Tenggara diikuti dengan peningkatan limbah berupa kulit durian. Kulit durian masih dapat dimanfaatkan sebagai bahan baku untuk produksi komponen lain dengan nilai tambah tinggi. Salah satunya adalah pektin yang merupakan bahan tambahan pangan (BTP) yang umum digunakan di industri pangan. Selain dimanfaatkan sebagai pemodifikasi reologi, pektin juga dapat dikembangkan sebagai ingredien untuk pangan fungsional karena memiliki beberapa aktivitas biologis yang bermanfaat bagi tubuh manusia. Aktivitas antibakteri dari pektin telah dipelajari sebelumnya, namun pektin dengan berat molekul (BM) tinggi yang umum digunakan sebagai BTP tidak dapat menunjukkan aktivitas antibakteri yang baik. Depolimerisasi pektin menggunakan proses panas untuk menurunkan BM dilakukan di penelitian ini untuk meningkatkan aktivitas antibakteri pektin kulit durian. Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan dan mempelajari hubungan antara BM, struktur kimia, dan aktivitas penghambatan bakteri dari pektin asal limbah kulit durian yang diberi perlakuan sterilisasi uap basah pada 121 °C selama 15 menit. Penelitian ini terdiri dari dua tahapan, yaitu (1) penelitian meta-analisis untuk merangkum hasil penelitian yang telah dipublikasikan terkait aktivitas antibakteri polisakarida secara umum, dan (2) penelitian di laboratorium untuk mempelajari pengaruh depolimerisasi terhadap pektin kulit durian secara khusus. Berat molekul (BM) polisakarida yang efektif sebagai antibakteri berdasarkan hasil tinjauan pustaka sangat bervariasi antar penelitian yang berbeda. Meta-analisis dilakukan untuk mengevaluasi pengaruh metode depolimerisasi terhadap aktivitas antibakteri dari berbagai jenis polisakarida. Cakupan diperluas selain pektin karena penelitian yang dipublikasikan terkait khusus pektin masih sangat terbatas. Studi meta-analisis dilakukan sesuai pedoman yang tercantum pada Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA). Kata kunci yang digunakan untuk pencarian literatur mencakup istilah Bahasa Inggris yang terdiri dari “polysaccharide”, “low molecular weight”, “water soluble”, “depolymerization”, “degradation”, “oligosaccharide”, dan “oligomer”. Publikasi yang diikutsertakan hanya artikel penelitian dalam Bahasa Inggris yang diterbitkan dari tahun 2000 hingga 2021. Data dianalisis menggunakan aplikasi OpenMEE. Hasil pencarian literatur mengidentifikasi 118 studi yang relevan dengan 65.55% dari jumlah tersebut adalah penelitian menggunakan kitosan. Polisakarida lain yang berhasil ditemukan meliputi polisakarida sulfat asal alga (n = 4), alginat (n = 6), β-glukan (n = 4), pektin (n = 4), xantan (n = 3), gom (n = 2), xilan (n = 2), agar (n = 1), maltodekstrin (n = 1), dan campuran polisakarida tidak diidentifikasi dari berbagai sumber alam (n = 7). Hasil meta-analisis mengungkapkan bahwa ada kecenderungan untuk polisakarida anionik dan nonionik untuk menghambat bakteri lebih baik pada nilai BM yang lebih rendah (< 10 kDa) dibandingkan dengan kitosan (10 – 100 kDa). Namun, analisis statistik untuk meta-analisis ini memiliki heterogenitas yang tinggi (I2 > 80%) yang membatasi interpretasi hasil. Heterogenitas ini tidak dapat ditentukan sumbernya setelah dilakukan berbagai analisis subgrup berdasarkan muatan polisakarida, metode depolimerisasi, berat molekul, dan jenis polisakarida. Karena heterogenitas tinggi juga ditemukan di dalam kelompok polisakarida yang sama, diduga ada struktur kimia lain yang berperan di dalam aktivitas antibakteri polisakarida selain BM. Sterilisasi komersial uap basah (121 °C selama 15 menit) dipilih sebagai metode untuk mendepolimerisasi pektin kulit durian. Aktivitas antibakteri dievaluasi menggunakan metode mikrodilusi untuk memperoleh nilai konsentrasi hambat minimal (KHM) dan konsentrasi bakterisidal minimal (KBM) terhadap bakteri uji Escherichia coli dan Staphylococcus aureus. Perubahan struktur yang terjadi diamati menggunakan analisis nuclear magnetic resonance (NMR). Fraksinasi menggunakan filtrasi membran digunakan untuk memisahkan sampel pektin kulit durian steril berdasarkan berat molekulnya, yaitu Fraksi < 20 kDa, Fraksi < 10 kDa, Fraksi < 5 kDa, dan Fraksi < 2 kDa. Data profil kimia NMR dan aktivitas antibakteri dari masing-masing fraksi lalu digunakan untuk analisis statistik menggunakan principal component analysis (PCA) dan orthogonal partial least square (OPLS) untuk mengetahui korelasi di antara kedua variabel tersebut. Berdasarkan hasil analisis aktivitas antibakteri, Fraksi < 20 kDa dan Fraksi < 10 kDa merupakan fraksi pektin kulit durian dengan aktivitas terbaik di penelitian ini. E. coli memiliki kecenderungan lebih resisten terhadap paparan pektin dibandingkan dengan S. aureus. E. coli juga cenderung tidak mengalami peningkatan aktivitas antibakteri lebih lanjut melalui filtrasi < 20 kDa berdasarkan nilai KHM. Hasil NMR memperlihatkan bahwa struktur pektin kulit durian terdiri dari homogalakturonan, rhamnogalakturonan-I, rantai samping berupa arabinan dan galaktan, serta pati sebagai kontaminan. Komponen non-polisakarida seperti komponen fenolik dan asam organik juga teridentifikasi berdasarkan analisis spektra NMR. Penurunan metil ester setelah sterilisasi mengindikasikan adanya reaksi demetilasi (pelepasan gugus ester metil) selama proses sterilisasi. Data geseran kimia 1H-NMR sebagai variabel profil kimia dan nilai KBM sebagai variabel aktivitas antibakteri dipilih untuk dianalisis lebih lanjut menggunakan OPLS. Hasil analisis OPLS memperlihatkan bahwa Fraksi < 5 kDa memisah dari fraksi pektin kulit durian steril lainnya dan diduga disebabkan oleh perbedaan profil kimia, terutama terkait dengan komponen non-polisakarida. Analisis S-plot menunjukkan bahwa asam galakturonat (dalam bentuk pektin dan bebas) menjadi biomarker penting untuk aktivitas antibakteri dari fraksi pektin kulit durian. Hal ini menguatkan hipotesis bahwa gugus karboksil bebas menjadi faktor yang menentukan aktivitas antibakteri dari pektin. Penurunan nilai derajat esterifikasi (DE) meningkatkan aktivitas antibakteri bersama dengan penurunan BM. Oleh karena itu, sterilisasi komersial dapat menjadi alternatif metode depolimerisasi pektin yang dapat sekaligus menurunkan jumlah gugus karboksil yang terikat gugus metil.

High consumption of durian fruit in Southeast Asian countries is accompanied by an increase of durian rind waste. Durian rind can still be used as raw material for the production of other components with high added value. One of them is pectin, which is a food additive commonly used in the food industry. Apart from being used as a rheology modifier, pectin can also be developed as an ingredient for functional foods because it has several biological activities that are beneficial for the human body. The antibacterial activity of pectin has been studied previously, but high molecular weight (MW) pectin which is commonly used as a food additive generally cannot exhibit good antibacterial activity. Depolymerization of pectin by heat treatment to reduce MW was carried out in this study to increase the antibacterial activity of durian rind pectin. This research aimed to compare and evaluate the relationship between MW, chemical structure, and bacterial inhibitory activity of pectin from durian rind waste that was treated with commercial sterilization at 121 °C for 15 minutes. This research consisted of two main stages, namely (1) meta-analysis study to summarize what was currently known about antibacterial activity of polysaccharides in general, and (2) laboratory research to investigate the effect of depolymerization on durian rind pectin specifically. The effective MW of polysaccharides as an antibacterial agent varied greatly between different studies according to the results of preliminary literature review. Meta-analysis was carried out to evaluate the effect of depolymerization methods on the antibacterial activity of various types of polysaccharides. The scope was expanded beyond pectin because published research specifically related to pectin was still very limited. The meta-analysis study was done based on the guidelines in the Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA). Keywords used for literature search included English terms consisting of "polysaccharide", "low molecular weight", "water soluble", "depolymerization", "degradation", "oligosaccharide", and "oligomer". The publications included in this analysis were only research articles in English published from 2000 to 2021. Data were analyzed using the OpenMEE application. The results of the literature search identified 118 relevant studies, of which 65.55% were studies using chitosan. Other antibacterial polysaccharides that were discovered included sulfated polysaccharides from algae (n = 4), alginate (n = 6), β-glucan (n = 4), pectin (n = 4), xanthan (n = 3), gum (n = 2), xylan (n = 2), agar (n = 1), maltodextrin (n = 1), and a mixture of miscellaneous polysaccharides from various natural sources (n = 7). The meta-analysis results revealed that there was a tendency for anionic and nonionic polysaccharides to inhibit bacteria greater at lower MW range (< 10 kDa) compared to chitosan (10 – 100 kDa). However, the statistical analysis for this meta-analysis had high unexplained heterogeneity (I2 > 80%) which limited the interpretation of the results. The source of this heterogeneity could not be determined even after various subgroup analyzes were conducted based on charge, depolymerization method, MW range, and type of polysaccharide. Because high heterogeneity was also found in the same group of polysaccharides, it was suspected that there were other chemical structures that played a role in the observed antibacterial activity of polysaccharides besides MW. Commercial moist-heat sterilization (121 °C for 15 minutes) was chosen as the method to depolymerize durian rind pectin in this research. The antibacterial activity was evaluated using the microdilution method to obtain minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) values against the test bacteria Escherichia coli and Staphylococcus aureus. The changes of structure were observed using nuclear magnetic resonance (NMR) analysis. Fractionation using membrane filtration was used to separate sterile durian rind pectin samples based on their MW, namely Fraction < 20 kDa, Fraction < 10 kDa, Fraction < 5 kDa, and Fraction < 2 kDa. NMR chemical profile data and antibacterial activity from each fraction were then used for analysis using principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squares (OPLS) to determine the correlation between the two variables. Based on the results of antibacterial analysis, Fraction < 20 kDa and Fraction < 10 kDa was the best fractions to inhibit bacterial growth compared to Fraction < 5 kDa and Fraction < 2 kDa. E. coli was more resistant to pectin exposure compared to S. aureus. The inhibition of E. coli also did not get enhanced by further filtration < 20 kDa based on the MIC value, signifying it higher resistance to low MW pectin. NMR results showed that the structure of durian rind pectin consisted of homogalacturonan, rhamnogalacturonan-I, side chains of arabinan and galactan, and starch as a contaminant. Non-polysaccharide components such as phenolic compounds and organic acids were also identified based on NMR spectra analysis. The decrease in methyl ester after sterilization indicated that demethylation reaction (release of methyl ester) occurred during the sterilization process. Chemical shift from the 1H-NMR spectra analysis as chemical profile variable and the MBC value as antibacterial activity variable was used for further analysis using OPLS. The results of OPLS analysis showed that the Fraction < 5 kDa was separated from the other sterile durian rind pectin fractions and the reason was deduced to be caused by differences in chemical profiles, especially related to non-polysaccharide components. S-plot analysis showed that galacturonic acid (in the form of pectin and free monomer) was an important biomarker for the antibacterial activity of the durian rind pectin. This strengthened the hypothesis that the free carboxyl group was an important factor that determines the antibacterial activity of pectin. Decreasing the value of the degree of esterification (DE) increased the antibacterial activity along with decreasing the MW. Therefore, commercial sterilization can be an alternative method for pectin depolymerization which can simultaneously reduce the number of carboxyl groups attached to methyl groups while cleaving its large backbone chain.