Keragaman Aktinobakteri Endofit Rhododendron zoelleri Melalui Pendekatan Kultivasi dan DGGE Gen 16S rRNA

Abstract

Rhododendron zoelleri merupakan spesies dari subgenus vireya dan dikelompokkan dalam famili Ericacea. Rhododendron dimanfaatkan sebagai tanaman hias dan sebagai tanaman obat tradisional. Rhododendron diketahui mampu menghasilkan senyawa bioaktif flavonoid dan terpenoid. Senyawa bioaktif dari Rhododendron diduga diproduksi oleh mikrob endofit yang terdapat dalam jaringan tanaman. Mikrob endofit dari kelompok aktinobakteri dikenal sebagai penghasil beragam senyawa bioaktif yang memiliki berbagai macam aktivitas biologis, sehingga informasi mengenai keragaman aktinobakteri sangat perlu dilakukan. Keragaman aktinobakteri culturable dapat diperoleh dengan kultivasi pada media tertentu dalam kondisi laboratorium. Namun 99% mikrob di alam tidak dapat dikulturkan sehingga diperlukan pendekatan metagenomik untuk mendapatkan informasi mengenai komunitas dan keragaman aktinobakteri endofit. Oleh karena itu penelitian ini bertujuan untuk mengkaji keragaman aktinobakteri endofit culturable asal R. zoelleri melalui kultivasi, dan total komunitas aktinobakteria endofit R. zoelleri unculturable melalui pendekatan metagenomik dengan PCR-DGGE berdasarkan gen 16S rRNA. Aktinobakteri endofit R. zoelleri berhasil diisolasi menggunakan media Humic Acid Vitamin Agar (HV) berjumlah 6 isolat, tiga isolat diisolasi dari daun dan tiga isolat diisolasi dari batang, purifikasi dilakukan pada media ISP 2 (International Streptomyses Project 2). Keenam isolat tersebut (RZP 1.3, RZP 1.1, RZP 2.2, RZPB 1.1, RZPB 7.1, RZPB 4.1) berdasarkan karakteristik morfologi (warna miselia substrat, miselia aerial, pigmentasi media, dan tipe penataan spora) merupakan kelompok Streptomyces yang memiliki ciri umum membentuk miselia aerial dan miselia substrat. Identifikasi molekuler dilakukan dengan ekstraksi DNA genom 6 isolat aktinobakteri endofit culturable asal R. zoelleri menggunakan Geneaid Genomic DNA Mini kit, dan dilanjutkan dengan amplifikasi gen 16S rRNA. Total komunitas aktinobakteri unculturable dianalisis dengan mengekstraksi DNA genom dari jaringan R. zoelleri menggunakan Geneaid Genomic DNA Mini Kit, Plant. Gen 16S rRNA diamplifikasi dengan nested PCR menggunakan primer spesifik aktinobakteri yang berukuran ±1087 bp dan primer universal yang berukuran ±180 bp. Analisis komunitas aktinobakteri unculturable dilakukan menggunakan teknik Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE). Komunitas aktinobakteri yang ditemukan dianalisis kekerabatannya berdasarkan gen 16S rRNA menggunakan software bioinformatika MEGA 6. Analisis pohon filogenetik berdasarkan sekuen gen 16S rRNA menunjukkan bahwa enam isolat (RZP 1.3, RZP 1.1, RZP 2.2, RZPB 1.1, RZPB 7.1, RZPB 4.1) berkerabat dekat dengan S. djakartensis strain NBRC 15409T, S. tritolerans strain DAS 165T, S. coelicoflavus strain NBRC 15399T dengan kemiripan 99%. Keenam isolat memiliki kemiripan yang tinggi dengan strain pembandingnya berdasarkan gen 16S rRNA, tetapi terdapat perbedaan morfologi antara isolat yang ditemukan dengan strain pembandingnya, sehingga besar kemungkinan ditemukan novel spesies melalui identifikasi dengan pendekatan polifasik taksonomi. iii Profil komunitas aktinobakteri endofit R. zoelleri berdasarkan gen 16S rRNA diwakili 13 pita DGGE yang berhasil diisolasi melalui pemotongan gel. Hasil separasi pita gen 16S rRNA dipotong dan dilakukan Re-PCR menggunakan primer non GC clamps untuk dilanjutkan ke tahap sekuensing. Pensejajaran basa nukleotida aktinobakteri endofit unculturable asal R. zoelleri terhadap galur pembandingnya dari database GenBank menunjukkan hubungan kekerabatan 13 pita dengan genus Streptomyces dan Non-Streptomyces yang dikenal dengan rareaktinobakteri yaitu genus Agromyces, Gordonia, Microbacterium, Micromonospora, Propionibacterium, Saccharomonospora, Streptomyces yang memiliki kemiripan berkisar 93.18%-100%. Komunitas aktinobakteri culturable yang diperoleh dengan teknik kultivasi menemukan isolat dari satu genus yaitu Streptomyces. Sedangkan dengan pendekatan metagenomik dengan teknik DGGE berhasil mengidentifikasi keduanya dari kelompok genus Streptomyces dan Non-Streptomyces yang dikenal dengan rare-aktinobakteri. Aktinobakteri endofit R. zoelleri didominasi oleh kelompok genus Agromyces, Gordonia, Microbacterium, Micromonospora, Propionibacterium, Saccharomonospora, Streptomyces. Pendekatan metagenomik dengan teknik DGGE mendapatkan lebih banyak genus aktinobakteria dibandingkan dengan teknik kultivasi melalui media isolasi. Namun dengan mengkombinasikan kedua pendekatan tersebut menyajikan informasi yang lebih lengkap mengenai profil komunitas aktinobakteri endofit R. zoelleri.