Analisis Transkriptomik dan Proteomik pada Spermatozoa Sapi Madura sebagai Biomarka Fertilitas.

Abstract

Sapi madura sebagai salah satu plasma nutfah sapi lokal Indonesia yang memiliki tiga kegunaan yaitu sebagai sapi karapan, sapi sonok dan sapi pedaging. Sapi madura mulai dikembangkan sebagai sapi pedaging untuk memenuhi kebutuhan daging nasional. Salah satu strategi yang diterapkan untuk meningkatkan populasi sapi madura yaitu melalui inseminasi buatan (IB) menggunakan semen beku. Seleksi sapi madura unggul dilakukan melalui metode breeding soundness examination (BSE) dengan kualitas semen yang baik dan berdasarkan standar nasional Indonesia (SNI). Pemeriksaan kualitas semen konvensional masih belum akurat untuk memprediksi fertilitas dengan persentase conception rate yang belum maksimal. Analisis berbasis omic dengan pemanfaatan biomarka banyak dikembangkan untuk mengidentifikasi faktor molekuler yang mempengaruhi fertilitas pejantan. Evaluasi kualitas spermatozoa dikombinasikan dengan penggunaan beberapa biomarka, dianggap dapat lebih akurat untuk seleksi fertilitas pejantan. Protein heat shock protein 70 member 2 (HSP70-2), protamin 1 (PRM1) dan ostepontin (OPN) merupakan 3 major protein yang terseleksi dan berkorelasi terhadap kualitas semen infertilitas, penurunan kualitas fungsional spermatozoa, hingga perkembangan awal embrio. Tujuan penelitian ini adalah mengkaji pemanfaatan HSP70-2, PRM1 dan OPN sebagai biomarka penanda fertilitas. Penelitian terdiri dari 4 bagian tujuan spesifik, diantaranya (1) menganalisis karakteristik spermatozoa post-thawing dengan perbedaan tingkat fertilitas di lapangan, (2) menganalisis ekspresi gen dan konsentrasi protein HSP70-2, PRM1 dan OPN spermatozoa serta korelasinya terhadap kualitas spermatozoa pada tingkat fertilitas berbeda, (3) mengidentifikasi karakteristik berat molekul protein HSP70-2, PRM1 dan OPN pada spermatozoa, dan (4) menganalisis pemanfaatan protein HSP70-2, PRM1 dan OPN untuk menilai fertilitas spermatozoa sapi Madura. Penelitian bagian pertama dengan tujuan menganalisis karakteristik spermatozoa post-thawing sapi madura dengan perbedaan tingkat fertilitas di lapangan. Sapi madura dikelompokkan ke dalam tingkat fertilitas berbeda berdasarkan pengolahan data %first service conception rate (%FSCR) menggunakan data iSIKHNAs tahun 2018-2020. Hasil pengelompokkan tingkat fertilitas sapi madura unggul menjadi 3 tingkat fertilitas yaitu high fertility (HF) (80,86%; n= 2 ekor), medium fertility (MF) (73,12%, n= 4 ekor) dan low fertility (LF) (69,92%; n= 2 ekor). Kualitas semen pada semua karakteristik spermatozoa post-thawing kecuali indeks fragmentasi DNA spermatozoa (DFI), signifikan lebih tinggi (P<0,05) pada sapi madura HF dibandingkan dengan MF dan LF. Indeks fragmentasi DNA spermatozoa pada sapi madura HF signifikan paling rendah (P<0,05) dibandingkan MF dan LF. Hasil evaluasi karakteristik spermatozoa yang diukur diketahui berkorelasi positif (P<0,01) terhadap tingkat fertilitas (TF), dengan parameter DFI berkorelasi negatif terhadap TF yang artinya semakin sedikit fragmentasi DNA yang ditemukan maka tingkat fertilitas tinggi. Hasil penelitian bagian dua dengan tujuan menganalisis ekspresi gen dan konsentrasi protein HSP70-2, PRM1 dan OPN spermatozoa post-thawing sapi Madura dan korelasinya terhadap kualitas spermatozoa pada tingkat fertilitas berbeda. qRT-PCR dengan PPIA sebagai gen housekeeping. Kelompok pejantan madura HF mengekspresikan mRNA HSP70-2 signifikan paling tinggi (P<0,01), dan menunjukkan adanya pengaruh kelimpahan ekspresi terhadap parameter kualitas spermatozoa, terutama motilitas, plasma membran utuh, dan akrosom spermatozoa (P<0,01). Tingkat transkrip PRM1 tidak berbeda secara signifikan antara kelompok MF dan LF. Namun, ekspresi PRM1 signifikan lebih tinggi pada kelompok sapi pejantan HF (P<0,05), serta menunjukkan pengaruh pada motilitas spermatozoa (P<0,01), akrosom utuh, dan DFI spermatozoa (P<0.05) pejantan HF. Ekspresi OPN tidak berbeda antar kelompok fertilitas dan tidak menunjukkan pengaruh yang signifikan dengan kualitas spermatozoa. Sementara, konsentrasi protein dengan ELISA dilakukan pada HSP70-2 dan PRM1 yang diekspresikan melimpah pada fertilitas tinggi (P<0,05) pada pejantan Madura high fertile (HF). Penelitian bagian ketiga dengan tujuan mengidentifikasi protein target HSP70-2, PRM1 dan OPN pada spermatozoa post-thawing sapi madura. Hasil penelitian menggunakan 1D-SDS PAGE teridentifkasi sebanyak 14 pita protein. Tiga pita protein yaitu HSP70-2, PRM1 dan OPN dengan berat molekul 75,35 kDa, 60,69 kDa, dan 5,36 kDa ditemukan pada spermatozoa pejantan sapi madura. Konsentrasi prediksi HSP70-2 yaitu 3378,104 a.u dan PRM1 sebesar 998,113 a.u tertinggi pada pejantan sapi madura HF. Konsentrasi terendah pada pejantan LF dengan prediksi HSP70-2 sebesar 1223,367 a.u dan prediksi PRM1 sebesar 372,042 a.u. Sementara itu, protein osteopontin (OPN) tidak menunjukkan pola yang berurutan terkait dengan kelompok fertilitas Penelitian bagian keempat ini memanfaatkan target potensial biomarka yang lebih sensitif pada spermatozoa sapi madura post-thawing yaitu HSP70-2, PRM1 dan OPN untuk menilai tingkat fertilitas, dan menilai ekspresi protein pada spermatozoa yang berkapasitas. Berdasarkan analisis bioinformatika dengan pendekatan DAVID dan STRING diketahui HSP70-2 berinteraksi dengan protein lain seperti HSPA9, ATPF51B, dan AKAP4 dikaitkan dengan motilitas sperma, respons stres termasuk stres cryofreezing, perlindungan dari stres oksidatif, terlibat dalam kapasitasi dan sperm egg recognition. Ekspresi protein HSP70-2, PRM1 pada penelitian ini juga memiliki korelasi positif dan sangat kuat dengan tingkat fertilitas pejantan sapi madura. Sehingga, berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulakan bahwa HSP70-2 bisa menjadi biomarka fertilitas potensial pada pejantan sapi Madura selain PRM1.