Biosensor Urea Menggunakan Whole Cell dan Biofilm Bacillus licheniformis sebagai Aplikasi Konsep Kimia Hijau

Abstract

Air merupakan salah satu sumber daya alam yang memiliki fungsi sangat penting untuk kehidupan manusia serta makhluk hidup lainnya sehingga kondisi perairan harus dijaga kualitasnya untuk kepentingan generasi sekarang, yang akan datang serta untuk menjaga keseimbangan ekosistem. Oleh karena itu perlu dilakukan upaya pengendalian pencemaran air dan pengelolaan kualitas air dengan cara pengujian atau pemantauan kualitas air sesuai dengan baku mutu air. Urea merupakan salah satu polutan nitrogen yang banyak terdapat di sektor pertanian, urea banyak digunakan sebagai pupuk namun hanya 50% yang terserap di tanaman dan sisanya akan terjadi leaching di perairan. Ambang batas urea di suatu perairan yaitu 80 mg/L atau 0,001 M. Limbah urea dapat mempengaruhi siklus nitrogen dan menimbulkan pencemaran air seperti terjadi eutrofikasi di perairan, pencemaran udara dikarenakan urea menguap menjadi amonia maupun menimbulkan pencemaran tanah yang mengakibatkan derajat keasaman atau pH tanah menjadi lebih asam. Pemantauan urea selain digunakan pada sektor lingkungan perairan, dapat juga digunakan pada sektor kesehatan untuk mendiagnosa penyakit gagal ginjal. Urea merupakan produk buangan dari sisa metabolisme. Apabila kadar urea dalam urin di atas ambang batas yaitu 0,10 sampai 0,40 M (6 sampai 24 g/L) maka seseorang tersebut didiagnosa mempunyai penyakit gagal ginjal karena fungsi ginjal kurang optimum untuk menyaring senyawa urea. Metode pemantauan urea yang sudah dikembangkan selama ini diantaranya berbasis dengan kromatografi cair kinerja tinggi, kromatografi gas, dan kolorimetri. Kekurangan metode deteksi urea sebelumnya adalah banyak menggunakan pelarut/reagen kimia yang kurang ramah lingkungan, membutuhkan waktu relatif lama untuk preparasi serta membutuhkan analis yang terlatih, maka penelitian ini berfokus mengembangkan metode alternatif dengan pendekatan analisis berbasis ramah lingkungan yaitu biosensor. Biosensor mempunyai keunggulan diantaranya analisis cepat, real time, hanya memerlukan sampel sedikit, preparasi yang cukup sederhana, dan ramah lingkungan. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis potensi Bacillus licheniformis dan Bacillus megaterium sebagai bioreseptor untuk mendeteksi urea, menguji whole cell Bacillus terpilih sebagai bioreseptor untuk mendeteksi konsentrasi urea pada sampel urin sintetik sebagai aplikasi biosensor elektrokimia, serta mengembangkan metode deteksi urea dengan pendekatan biosensor berbasis biofilm Bacillus terpilih secara elektrokimia. Bacillus licheniformis terpilih sebagai bioreseptor untuk pengujian urea, karena secara kualitatif Bacillus licheniformis menghasilkan enzim urease yang lebih tinggi dibandingkan dengan Bacillus megaterium. Hal ini ditandai dengan adanya perubahan warna media Christensen’s agar dari awalnya berwarna kuning menjadi merah muda. Perubahan warna media terjadi karena di dalam media Christensen’s agar terdapat indikator phenol red. Phenol red digunakan sebagai indikator perubahan pH. Ketika pH basa, warna akan berubah menjadi merah muda. Hasil dari penguraian reaksi urea yaitu amonia dan karbondioksida. Amonia yang diproduksi akan meningkatkan pH media menjadi bersifat basa dengan perubahan media berwarna kuning (pH 6,80) menjadi merah muda (pH 8,10). Bacillus licheniformis terbukti berpotensi sebagai bioreseptor urea, karena menghasilkan arus oksidasi pada voltamogram siklik. Kemudian dilakukan optimasi voltamogram siklik. Optimasi voltamogram siklik dilakukan untuk menghasilkan arus oksidasi amonia yang maksimal, diantaranya yaitu 20 mV/s kecepatan laju payaran, 0,75 kerapatan sel Bacillus licheniformis, dan pH Phosphate Buffer Solution 9. Biosensor urea berbasis whole cell ini mempunyai kinerja analitik sebagai berikut Limit Deteksi (LD) 0,05 M; sensitivitas 0,0974 µA/M, dan rentang linearitas konsentrasi urea dari 0,05 M sampai 1,00 M dengan R2 0,994. Biosensor urea berbasis whole cell ini tergolong sederhana, karena bioreseptor yang digunakan yaitu menggunakan dari whole cell bakteri tanpa melakukan isolasi enzim, serta enzim yang terdapat di dalam sistem whole cell sudah dalam kondisi yang stabil karena terdapat sesuai pada lingkungannya. Keunggulan dari sistem biosensor ini diantaranya hanya menggunakan sedikit sampel, dan ramah lingkungan. Dalam sistem ini hanya menggunakan 40 µL sampel. Metode ini juga termasuk ramah lingkungan atau tergolong green chemistry, hal ini karena pelarut yang digunakan adalah akuades sehingga aman untuk lingkungan. Biosensor elektrokimia whole cell Bacillus licheniformis juga dapat diaplikasikan untuk mendeteksi konsentrasi urea pada sampel urin sintetik. Performa biosensor ini yaitu LD 0,01 M, sensitivitas 1,278 µA/M, dan rentang linearitas konsentrasi urea dari 0,01 M sampai 0,20 M dengan R2 0,990. Pengembangan metode deteksi urea dengan pendekatan biosensor berbasis biofilm Bacillus licheniformis secara elektrokimia berhasil dilakukan. Media terbaik untuk menghasilkan pembentukan biofilm Bacillus licheniformis terbaik adalah media Brain Heart Infusion dengan penambahan 1% glukosa. Hal ini karena media Brain Heart Infusion mempunyai sumber nutrien yang lebih kaya dibandingkan dengan media Tryptose Soy Broth dan Luria Bertani. Glukosa juga berperan sebagai suplemen sumber karbon, sehingga pertumbuhan biofilm Bacillus licheniformis lebih cepat dan lebih banyak. Uji hidrofobisitas berfungsi untuk menentukan sifat biofilm dari bakteri Bacillus licheniformis. Apabila bakteri dicelupkan di dalam air tidak mudah lepas dari inangnya maka bakteri tersebut tergolong bakteri dengan tingkat hidrofobisitas tinggi, sehingga air tidak bisa masuk ke dalam sistem biofilm bakteri. Hal ini akan berpengaruh terhadap stabilitas, semakin tinggi %hidrofobisitas maka semakin stabil biofilm dari bakteri tersebut. Penggolongan persentase hidrofobisitas bakteri jika kurang dari 30% tergolong hidrofilik, atau jika lebih dari 70% termasuk hidrofobik, sedangkan persentase 30 sampai 70 tergolong cukup hidrofobik. Hasil menunjukkan bahwa Bacillus licheniformis mempunyai prosentase hidrofobisitas 89%, sehingga isolat Bacillus licheniformis tergolong bakteri hidrofobik tinggi dan mengindikasikan baik digunakan sebagai biofilm karena mempunyai stabilitas yang tinggi. Performa biosensor ini yaitu LD 0,05 M, sensitivitas 3,046 µA/M, dan rentang linearitas konsentrasi urea dari 0,05 M sampai 1 M dengan R2 0,933.

Water is one of natural resources which has an important function for human life and other organisms, so that the water condition should be preserved its quality for the present and future generations, besides keeping the ecosystem balance. Therefore, it is necessary to conduct a maintenance effort for water pollution and water quality management by water quality assessment or monitoring based on the water quality standard. Urea is one of the nitrogen pollutants abundant in an agricultural sector. Urea is mostly used as a fertilizer, but only 50% of which is absorbed in plants and the residue will be leaching in the water. The threshold for urea in waters is 80 mg/L or 0.001 M. Urea waste can affect the nitrogen cycle and cause the water pollution such as water eutrophication, air pollution as urea evaporates to ammonia, and soil pollution which causes the soil pH becomes more acidic. In addition to urea monitoring used in water environmental sector, it can also be used on the health sector for diseases diagnosis. Urea is a waste product from the metabolism residue. When the urea content in urine is above the threshold level from 0,10 until 0,40 M (6 until 24 g/L), then the patient is diagnosed to suffer from a kidney failure as kidney has less optimum capability in filtering the urea compound. Urea monitoring that has been developed lately is based on high performance liquid chromatography, gas chromatography, and colorimetry. The disadvantages of these detection methods for urea are using more solvent/chemical reagent that is less environmentally friendly, requiring relatively long period for preparation, and requiring a skilled analyst. Therefore, this study was focused on developing an alternative method with an environmentally friendly analysis approach called biosensor. Biosensor has advantages, such as faster analysis, real-time analysis, and only requiring a small sample, simpler preparation, and environmentally friendly. This study aimed to analyze the Bacillus licheniformis and Bacillus megaterium potential as bioreceptors to detect urea, assess the selected Bacillus whole-cell as bioreceptors to detect the urea concentration in a synthetic urine sample as an electrochemical biosensor application, and develop urea detection method through selected Bacillus whole-cell biofilm based electrochemical biosensor. Bacillus licheniformis were selected as bioreceptors due to qualitatively producing higher urease enzyme than Bacillus megaterium. This condition was marked from the Christensen’s agar media color changing from yellow to pink. The color media changing occurred as the Christensen’s agar contained a phenol red indicator. Phenol red was used as a pH changing indicator. When the pH is base, the color will change into pink. The urea degrading reaction results are ammonia and carbondioxide. The ammonia produced will increase the pH media to basic by changing the color media from yellow (pH 6.80) to pink (pH 8.10). Bacillus licheniformis was proven to have urea bioreceptor potential due to producing an oxidative current in the cyclic voltammogram. Then, the cyclic voltammogram optimization was performed. The cyclic voltammogram optimization was performed to produce maximum ammonia oxidative current, namely at 20 mV/s pay line speed, 0.75 cell density of Bacillus licheniformis, and PBS pH of 9. This whole-cell based urea biosensor had an analytical performance, namely limit detection (LD) of 0.05 M, sensitivity of 0.0974 µA/M, and urea concentration linearity range from 0.05 M to 1.00 M with R2 of 0.994. This whole-cell based biosensor urea was relatively simple, as the bioreceptor used was the whole-cell bacteria without enzyme isolation and the enzyme in the whole-cell system was in a stable condition following its environmental condition. The advantages of this biosensor system are only using small sample and environmentally friendly. This system only uses 40 µL of the sample. This method is also included in an environmentally friendly or green chemistry method as the solvent used is aquadest, which is safe for the environment. The electrochemical biosensor of the whole-cell Bacillus licheniformis can also be applied to detect the urea concentration in a synthetic urine sample. This biosensor performance was the LD of 0.01 M, sensitivity of 1.278 µA/M, and urea concentration linearity range from 0.01 M to 0.20 M with R2 of 0.990. The urea detection development with Bacillus licheniformis biofilm based electrochemical biosensor was successfully performed. The best media to produce the biofilm formation of Bacillus licheniformis was the Brain Heart Infusion media with 1% glucose addition. This condition was performed as the Brain Heart Infusion had richer nutrients than the Tryptose Soy Broth and Luria Bertani media. Glucose also had a role as carbon source supplementor, which proliferated the Bacillus licheniformis biofilm faster and more abundant. The hydrophobicity test serves to determine the biofilm properties of Bacillus licheniformis bacteria. If the bacteria immersed in water are not easily released from the host can be classified as bacteria with high hydrophobicity level, so that the water cannot enter the bacterial biofilm system. This condition influences the stability, as the higher hydrophobicity percentage obtained, the more stable biofilm bacteria formed. Bacteria can be classified based on the hydrophobicity percentage; bacteria with 30% hydrophobicity are hydrophilic, >70% hydrophobicity are hydrophobic, and 30-70% hydrophobicity are quite hydrophobic. The results showed that the Bacillus licheniformis obtained the hydrophobicity percentage of 89%, which classified the Bacillus licheniformis isolate was high hydrophobic bacteria and indicates to be good for biofilm formation with high stability level. This biosensor performance was the LD of 0.05 M, sensitivity of 3.046 µA/M, and urea concentration linearity range from 0.05 M to 1 M with R2 of 0.933.