Potensi Tumbuhan Curculigo spp. sebagai Antidiabetes: Pendekatan Berbasis Anatomi dan Histokimia, Metabolomik, Bioinformatika, dan Bioteknologi

Abstract

Diabetes mellitus (DM) adalah penyakit yang disebabkan karena kurangnya produksi insulin atau ketidakmampuan sel dalam merespon insulin (resistensi insulin). Menurut International Diabetes Federation (2021), kasus DM di dunia mencapai 463 juta dan diperkirakan akan meningkat menjadi 700 juta pada tahun 2045. Kecenderungan peningkatan kasus dan tingkat kematian akibat DM perlu mendapatkan perhatian khusus, terutama pada pola pengobatannya. Pengobatan DM dengan menggunakan bahan alam menjadi salah satu bidang yang banyak diteliti di dunia karena efektif dan aman. Curculigo latifolia Dryand. ex W.T.Aiton dan Curculigo orchioides Gaertn. termasuk ke dalam famili Hypoxidaceae, herba tahunan dengan daun berbentuk lanset atau lanset sejajar tersusun roset, bunga kuning, batang sangat pendek, dan memiliki rimpang berbentuk silinder panjang. Sebanyak 39 spesies dari genus ini berstatus diterima (accepted) dalam World Checklist of Selected Plant Families (WCSP 2020), termasuk kedua spesies ini. Kedua spesies dikenal sebagai tumbuhan obat tradisional di berbagai wilayah tropis. Rimpang dari Curculigo spp. merupakan salah satu sumber bahan baku obat tradisional, untuk mengobati penyakit DM, efek farmakologi ini bersumber dari metabolit sekundernya. Metabolit ini terdistribusi dan terakumulasi pada struktur sekretori tertentu. Namun, kandungan senyawa aktif pada tumbuhan yang begitu beragam sangat sulit untuk ditentukan aktivitasnya, serta parameter farmakokinetik dan farmakodinamiknya dalam waktu yang singkat. Di samping itu, senyawa yang diproduksi dalam keadaan normal di alam sangat rendah. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk mengetahui distribusi struktur sekretori penghasil dan/atau penimbun senyawa bioaktif termaksud melalui uji histokimia, menentukan senyawa bioaktif yang berkontribusi paling besar terhadap diabetes mellitus, terutama aktivitas antioksidan dan penghambatan α-glukosidase, menentukan parameter farmakokinetik dan farmakodinamiknya. Di samping itu, penelitian ini juga dilakukan untuk memproduksi kalus dan mikropropagasi, serta memastikan adanya produksi senyawa bioaktif tersebut dalam sel/kalus hasil kultur in vitro. Determinasi struktur sekretori menggunakan penampang melintang dari sampel segar menurut prosedur anatomis tumbuhan dan analisis histokimia menggunakan beberapa jenis pereaksi untuk mendeteksi golongan senyawa. Penentuan senyawa bioaktif menggunakan kombinasi analisis antara aktivitas biologis (antioksidan dan penghambat α-glukosidase) dengan metabolomik berbasis metabolit sidik jari menggunakan FTIR dan pemrofilan metabolit menggunakan UHPLC-Q-Orbitrap HRMS serta teknik kemometrik menggunakan analisis regresi kuadrat terkecil parsial (PLSR). Parameter farmakokinetik dan farmakodinamik, ditentukan menggunakan aturan lima Lipinski, jejaring farmakologi menggunakan Cytoscape, dan penambatan molekuler menggunakan PyRx, PyMOL, dan BIOVIA Discovery Studio. Produksi kalus dan mikropropagasi diawali dengan sterilisasi eksplan menggunakan sterilan yang aman, inisiasi kalus dan organogenesis menggunakan variasi konsentrasi auksin dan sitokinin. Identifikasi senyawa pada kalus dan organ hasil mikropropagasi menggunakan analisis metabolomik berbasis pemrofilan metabolit menggunakan UHPLC-Q-Orbitrap HRMS serta teknik kemometrik menggunakan analisis komponen utama (PCA). Hasil analisis anatomi dan histokimia jaringan menunjukkan bahwa semua organ pada tumbuhan mengandung struktur sekretori yang mengakumulasi berbagai metabolit. Struktur sekretori yang teridentifikasi pada akar, rimpang, pelepah, dan daun pada kedua spesies ini berupa: rongga sekretori dan idioblas. Golongan senyawa yang teridentifikasi pada sekretori ini berupa fenol, alkaloid, terpena, minyak esensial, dan lipofilik. Beberapa metabolit sekunder terakumulasi pula di jaringan umum pada organ tumbuhan ini. Pendekatan berbasis metabolomik dan kemometrik, menunjukkan bahwa senyawa yang berkontribusi besar dalam aktivitas antioksidan dan penghambatan α-glukosidase, dari golongan fenol seperti: curculigoside B, orchioside B; 2,4-Dikloro-5-metoksi-3-metilfenol, glukosida orcinol; 1,1-Bis-(3,4-dihidroksifenil)-1-(2-furan)-metan, dari golongan terpena seperti: curculigosaponin G, H, dan I; dari golongan norlignan yaitu (1S,2R)-O-Methylnyacoside, serta dari golongan aldehida yaitu 5 Hidroksimetilfurfural, sedangkan gugus fungsi yang berkontribusi penting pada senyawa tersebut, antara lain: O–H, C=O, C–O, C–H. Senyawa-senyawa tersebut banyak terakumulasi pada organ daun C. latifolia (DLSP) dari Sinjai-Palangka dan C. orchioides (DOGM) dari Gowa-Malakaji. Parameter farmakokinetik, menunjukkan 33 dari 79 senyawa dapat diabsorpsi dengan baik, sedangkan beberapa senyawa tidak memenuhi syarat aturan lima Lipinski, sawar darah otak, absorpsi intestinal manusia, dan permeabilitas Caco-2, sehingga harus diubah ke dalam bentuk aglikon jika akan digunakan sebagai bahan obat. Ligan Cynanuriculoside A_qt berdasarkan analisis jejaring farmakologi dan penambatan molekul secara farmakodinamik, berinteraksi dengan target hidroksisteroid (11-beta) dehidrogenasi 1 (HSD11B1) melalui reseptor 6NJ7, dan afinitas yang dihasilkan sebesar –12,0 (kkal mol–1), dengan residu asam amino berupa Ala-226, Leu-126, Val-180, Tyr-183, Leu-215, Ser-170, Ile-121, dan Val-168. Metode sterilisasi eksplan daun dengan bahan sterilan pada konsentrasi terendah serta waktu kontak yang singkat menghasilkan kultur steril yang lebih banyak, yaitu 90% untuk C. latifolia dan C. orchioides. Kombinasi zat pengatur tumbuh (ZPT) untuk induksi kalus pada C. latifolia dan C. orchioides yang terbaik yaitu BAP : IBA, masing-masing dengan perbandingan konsentrasi 3 : 5 dan 5 : 3 (mg L–1), yang menghasilkan kalus berwarna hijau dan putih dengan konsistensi yang kompak. Kombinasi ZPT tersebut, juga dapat meregenerasi tunas dan dan akar pada kedua spesies ini. Struktur sekretori yang teridentifikasi pada kalus yaitu rongga sekretori dan sel idioblas. Pada kalus C. latifolia, fenol teridentifikasi pada bagian organogenik dan sel epitelium pada rongga sekretori, serta minyak esensial pada sel idioblas, sedangkan C. orchioides mengandung fenol hanya pada bagian organogenik. Senyawa yang memiliki kontribusi besar dalam aktivitas antioksidan dan penghambatan α-glukosidase, seperti: 1,1-Bis-(3,4-dihidroksifenil)-1-(2-furan)-metan, (1S,2R)-O-Methylnyacoside; 2,4-Dikloro-5-metoksi-3-metilfenol, curculigoside B, curculigosaponin G, H, dan I; orchioside B, dan glukosida orcinol yang teridentifikasi pada organ kedua spesies, juga teridentifikasi pada kalus dan daun planlet hasil mikropropagasinya. Sebagian besar termasuk dalam golongan fenol. Simpulan umum dari penelitian ini, yaitu teknik histokimia menunjukkan adanya perbedaan lokasi akumulasi metabolit pada masing-masing organ dari Curculigo spp. Secara histokimia, senyawa fenol teridentifikasi pada organ rimpang, pelepah, dan daun C. latifolia, sedangkan pada C. orchioides hanya teridentifikasi pada rimpang. Selain itu, fenol juga teridentifikasi pada sel-sel organogenik kalus dari kedua spesies ini. Pada analisis metabolomik-kemometrik, senyawa-senyawa yang berkontribusi besar dalam aktivitas antioksidan dan penghambatan α-glukosidase banyak terakumulasi pada organ daun dari kedua spesies ini. Pada pendekatan jejaring farmakologi dan penambatan molekuler, teridentifikasi senyawa seperti cynanuriculoside A_qt, curculigosaponin L_qt, dan curculigenin B yang berpotensi dalam pengobatan diabetes mellitus. Senyawa-senyawa pada tumbuhan asal C. latifolia dan C. orchioides yang berkontribusi besar terhadap aktivitas antioksidan dan penghambatan α-glukosidase, juga teridentifikasi pada kalus dan daun hasil mikropropagasinya, bahkan di antara senyawa tersebut memiliki konsentrasi (luas peak area) yang lebih besar dari organ tumbuhan asalnya.

Diabetes mellitus (DM) is a disease caused by lacking of insulin production or by the inability of cells to respond to insulin (insulin resistance). According to the International Diabetes Federation, diabetes cases in the world reach 425 millions and are predicted to increase to 625 millions by 2045. The trend of increasing cases and death rates due to diabetes needs a special attention, especially in the pattern of it’s treatment. Diabetes treatment using natural ingredients is one of the most researched fields in the world because it is effective and safe. Curculigo latifolia Dryand. ex W.T. Aiton and Curculigo orchioides Gaertn. belonging to the family Hypoxidaceae, annual herbs with lanceolate-shaped leaves or parallel lanceolate arranged in a rosette, with yellow flowers, very short stems, and have a long cylindrical rhizome. A total of 39 species of this genus are accepted in the World Checklist of Selected Plant Families (WCSP 2020), including these two species. Both species are known as traditional medicinal plants in various tropical regions. Rhizome of Curculigo spp. is one of the raw material sources for traditional medicine to treat DM; this pharmacological effect comes from secondary metabolites. Those compounds are distributed and accumulated in certain secretory structures within the plant. However, the activities of the active compounds in such diverse plant organs are very difficult to be determined in a short time, as well as its pharmacokinetic and pharmacodynamics parameters. In addition, compounds produced under normal conditions in the nature are very low. Therefore, this study aimed to determine the distribution of secretory structures and the producing and/or accumulating sites of the bioactive compounds through histochemical tests, to determine which bioactive compounds contribute the most to diabetes mellitus, especially in antioxidant activity and α-glucosidase inhibition, and to determine their pharmacokinetics and pharmacodynamics parameters. In addition, this research was also carried out to produce callus and micropropagate the plants, as well as to ensure the existence of those bioactive compounds in in vitro cultured callus. Determination of secretory structure using cross sections of fresh samples according to plant anatomical procedures and histochemical analysis using several reagents were performed to detect groups of metabolites. Determination of bioactive compounds was done using an analysis combination on biological activities (antioxidants and α-glucosidase inhibition) with metabolite fingerprint using FTIR and metabolite profiling with UHPLC-Q-Orbitrap HRMS-based metabolomic and chemometric techniques using partial least squares regression analysis (PLSR). Pharmacokinetics and pharmacodynamics parameters were determined using Lipinski's rule of five, pharmacological networks using Cytoscape, and molecular docking with PyRx, PyMOL, and BIOVIA Discovery Studio. Callus production and micropropagation began with explant sterilization using environmental-friendly sterilants. Callus initiation and organogenesis were induced by various concentrations of auxins and cytokinin. Metabolomic analysis based on metabolite profiling using UHPLC-Q-Orbitrap HRMS and chemometric techniques using principal component analysis (PCA) were carried out to identify the compounds in the callus and plantlet’s leaves. The anatomical and histochemical analysis of fresh tissues showed that all organs contained secretory structures that accumulated various metabolites. The secretory structures identified in the roots, rhizomes, petiole, and leaves of these two species were secretory cavities and idioblasts. The group of compounds identified were phenols, alkaloids, terpenes, essential oils, and lipophilic. They were also spread over some common tissues of the organs. Based on metabolomic and chemometric analysis the main compounds contributing in antioxidant and α-glucosidase inhibition activities were notified from the phenol group, such as curculigoside B, orchioside B; 2,4-Dichloro-5-methoxy-3-methylphenol, orcinol glucoside; 1,1-Bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-1-(2-furan)-methane; from the terpene group, such as: curculigosaponin G, H, and I; from the norlignan group, (1S,2R)-O-Methylnyacoside; and from the aldehyde group, 5-hydroxymethylfural, while the functional groups included O–H, C=O, C–O, C–H. These compounds were accumulated more abundantly in the leaves of C. latifolia (DLSP) from Sinjai-Palangka and C. orchioides (DOGM) from Gowa-Malakaji. Pharmacokinetic parameters showed that 33 out of the 79 compounds were able to be absorbed properly, while some compounds did not meet the requirements. The latter compounds must be converted into aglycones if they will be used as medicinal substances. The cynanuriculoside ligand A_qt based on pharmacological network analysis and molecular docking was able to interact pharmacodynamically with hydroxysteroid (11-beta) dehydrogenase 1 (HSD11B1) target via 6NJ7 receptor, resulting an affinity of –12.0 (kcal mol–1), with amino acid residues in the form of Ala 226, Leu 126, Val 180, Tyr 183, Leu 215, Ser 170, Ile 121, and Val 168. The sterilization of explants with the lowest concentrations of sterilizing agents and a short contact time with the explants produced 90% sterile cultures. The best combination of plant growth regulators (PGRs) for callus induction in C. latifolia and C. orchioides were BAP : IBA at 3 : 5 and 5 : 3 mg L–1, respectively. The callus were green and white, with a compact consistency. Those combinations of PGRs also regenerated shoots and roots in both species. The secretory structures found in the callus were secretory cavities and idioblast cells. In the callus of C. latifolia, phenol was identified in the organogenic parts and epithelium cells of the secretory cavities, and the essential oils were in idioblast cells; while C. orchioides’ callus contained phenol in the organogenic parts only. The compounds that had contribution in antioxidant and α-glucosidase inhibition activities, such as 1,1-Bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-1-(2-furan)-methane, (1S,2R)-O-Methylnyacoside; 2,4-Dichloro-5-methoxy-3-methylphenol, curculigoside B, curculigosaponin G, H, and I; orchioside B, and orcinol glucoside were also identified in the callus and plantlet’s leaves. Most of them belong to the phenol group. The general conclusion of this study is that histochemical techniques revealed that there were differences in the accumulation sites of compounds among organs of Curculigo spp. Histochemically, phenolic compounds were identified in the rhizome, petiole, and leaves of C. latifolia, while in C. orchioides they were only identified in the rhizome. Phenolics were also found in the organogenic callus of these two species. From the metabolomic-chemometric analysis, compounds that contributed greatly to the antioxidant and α-glucosidase inhibition activities were accumulated in the leaves of both species. From the pharmacological network and molecular docking approaches, cynanuriculoside A_qt, curculigosaponin L_qt, and curculigenin B were confirmed to have potential for the treatment of diabetes mellitus. The compounds found in the plant’s organs of C. latifolia and C. orchioides that contribute greatly in antioxidant and α-glucosidase inhibition activities were also identified in the callus and plantlet’s leaves resulted from in vitro cultures. Some of which even demonstrated higher concentration (peak area) than those of the original plant organs.