Karakteristik Molekuler Enzim Fibrinolitik dari Bacillus subtilis Asal Moromi Melalui Kajian Bioinformatika

Abstract

Penyakit kardiovaskuler seperti stroke dan jantung merupakan salah satu penyebab kematian di dunia, termasuk Indonesia. Menurut WHO 2017, pada tahun 2016 sekitar 17.9 juta orang meninggal (sebesar 31% dari tingkat kematian di dunia) karena penyakit kardiovaskular, serta dari jumlah ini sebanyak 85% disebabkan oleh serangan jantung dan stroke. Salah satu dasar patofisiologi dari stroke adalah atero-tromboembolik (trombosis), yaitu suatu keadaan dimana bekuan-bekuan darah melekat dan beragregasi pada pembuluh darah yang terluka sehingga menyebabkan penyumbatan aliran darah. Enzim fibrinolitik dari mikroba pangan telah menarik minat ahli medis untuk dikembangkan sebagai agen trombolitik. Di antara bakteri, sebagian besar dari anggota genus Bacillus telah dipelajari mengenai enzim fibrinolitik dan sifat-sifatnya. Genus Bacillus dari berbagai pangan fermentasi yang ditemukan mampu menghasilkan aktivitas protease fibrinolitik yang kuat, antara lain Bacillus natto dari natto, Bacillus amyloliquefaciens DC-4 dari douchi; Bacillus amyloliquefaciens MJ5-41 dari meju; Bacillus licheniformis, Bacillus cereus, Brevibacillus laterosporus, dan Bacillus pumilus dari oncom merah dan tempe gembus; serta Bacillus coagulans dari terasi. Penelitian di Indonesia mengenai enzim fibrinolitik dari pangan fermentasi masih terbatas, padahal Indonesia dikenal sebagai negara yang kaya produk pangan fermentasi seperti tempe, tauco, tempe gembus, oncom merah, tempoyak, jambal roti, dan tuak. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan kajian terhadap enzim fibrinolitik mikroba dari produk fermentasi moromi. Dalam mencari informasi dasar dan molekuler enzim fibrinolitik, temuan mikroba fibrinolitik lokal adalah tahap awal yang perlu diikuti oleh tahap berikutnya yaitu mencari informasi mengenai gen penyandi enzim fibrinolitik dan karakterisasinya, serta mencari informasi melalui kajian bioinformatika terkait interaksi yang terjadi antara enzim fibrinolitik dengan substratnya yaitu fibrin dan fibrinogen. Pemanfaatan tools pada bioinformatika dapat memberikan berbagai informasi penting, khususnya dalam studi ini terkait karakteristik molekuler enzim yang diisolasi dari Bacillus subtilis K2 asal pangan fermentasi moromi. Penelitian ini berhasil mengisolasi bakteri penghasil protease fibrinolitik dari pangan fermentasi Indonesia, moromi. Sebanyak tiga isolat menunjukkan aktivitas proteolitik pada media skim milk agar dan juga menunjukkan aktivitas fibrinolitik yang kuat berdasarkan pada uji fibrin plate. Ketiga isolat (K1, K2, dan K3) diidentifikasi menggunakan kit API 50 CHB dan identifikasi molekuler melalui analisis sekuen gen 16S rRNA. Hasil uji biokimia menggunakan kit API 50 CHB menunjukkan bahwa isolat K1 diidentifikasi sebagai Bacillus cereus 1 (99.8%), K2 sebagai Bacillus subtilis (97%), dan K3 sebagai Bacillus cereus (99%). Identifikasi molekuler berdasarkan gen 16S rRNA menunjukkan bahwa K1 dikonfirmasi sebagai Bacillus cereus 1 (100%), K2 sebagai Bacillus subtilis (99.86%), dan K3 sebagai Bacillus cereus (97.56%). Urutan nukleotida didepositkan pada GenBank dengan accession number MK045762 untuk K1, MK652831 untuk K2, dan MK530096 untuk K3. Isolat K2 (Bacillus subtilis K2) yang difermentasi selama 1 hari memiliki aktivitas fibrinolitik yang hampir mirip dengan enzim fibrinolitik komersial, lumbrokinase yang diisolasi dari cacing tanah. Berdasarkan analisis morfologi, biokimia, dan gen penyandi 16S rRNA, satu isolat yang memiliki aktivitas proteolitik dan fibrinolitik tertinggi diidentifikasi sebagai Bacillus subtilis K2. Analisis BLASTn dari sekuens nukleotida menunjukkan homologi sebesar 73.6% dengan gen penyandi enzim pendegradasi fibrin Nattokinase dari Bacillus subtilis subsp. natto yang diisolasi dari kedelai fermentasi di Jepang. Analisis sekuens asam amino putatif melalui Prosite mengindikasikan bahwa Subtilisin K2 tergolong enzim protease serin dengan asam amino aspartat, histidin dan serin yang khas dalam catalytic triad. Analisis bioinformatik dengan menggunakan ProtParam menunjukkan enzim ini memiliki nilai pI sebesar 6.02, tingkat kestabilan yang tinggi, indeks alifatik tinggi, nilai GRAVY yang rendah, serta memiliki bobot molekul sebesar 26 kDa yang telah dikonfirmasi juga melalui analisis zimogram. Analisis bioinformatik dengan menggunakan Webserver CDART dan Myhits menunjukkan bahwa enzim subtilisin K2 ini memiliki domain lestari yang berasal dari super famili peptidase s8 dengan motifnya berupa: Asp subtilase, His subtilase, dan Ser subtilase. Webserver SOPMA yang digunakan untuk menganalisis struktur sekunder dari Subtilisin K2 menunjukkan bahwa enzim ini terdiri dari 24.52% alfa heliks, 24.52% lembaran beta, 11.49% beta turns, dan 39.46% random coil. Komposisi alfa heliks, lembaran beta, dan beta turns dari Subtilisin K2 lebih tinggi daripada Nattokinase. Hal ini menunjukkan struktur dari Subtilisin K2 tidak sama persis dengan struktur Nattokinase, serta berkorelasi dengan stabilitas Subtilisin K2 yang diprediksi lebih tinggi daripada Nattokinase. Webserver HADDOCK digunakan untuk menganalisis penambatan molekul antara enzim pendegradasi fibrin dan substrat spesifik, fibrin dan fibrinogen yang bertujuan untuk memprediksi mekanisme kerja enzim pendegradasi fibrin ini. Analisis ini menunjukkan bahwa tidak ada interaksi yang produktif antara Subtilisin K2 dan fibrinogen. Namun, reaksi hidrolisis terindikasi kuat antara Subtilisin K2 dan substrat fibrin. Asam amino Asp19, His51, dan Ser208 sebagai residu sisi aktif dari Subtilisin K2 berinteraksi dengan Leu168, Ile171, dan Leu172 pada domain E dari substrat fibrin dengan nilai ΔG negatif (–19.4 kkal mol-1) dan nilai Kd yang rendah (6.3E-15 M) yang menunjukkan spesifisitas substrat yang sesuai. Subtilisin K2 lebih cenderung bertindak sebagai enzim pendegradasi fibrin daripada sebagai enzim pendegradasi fibrinogen.

Cardiovascular diseases (CVDs), including stroke and heart diseases have been identified as one of the leading cause of death worldwide. Meanwhile, WHO data estimated about 17.9 million related deaths in 2016, which represents 31% of all global cases, and about 85% occurred due to heart attack and stroke. One of the basic pathophysiology of stroke is atero-thromboembolic (thrombosis), a condition that occured due to blood clots attach and aggregate to the injured blood vessels, which cause blockage of blood flow. Fibrinolytic enzymes from food microbes have attracted medical interest to be developed as thrombolytic agents. Among bacteria, many of the members of the genus Bacillus have been studied for their fibrinolytic enzymes and their properties. Genera of Bacillus from various fermented foods have been found capable of producing strong fibrinolytic enzymes, including Bacillus natto from natto, Bacillus amyloliquefaciens DC-4 from douchi; Bacillus amyloliquefaciens MJ5-41 from meju; Bacillus licheniformis, Bacillus cereus, Brevibacillus laterosporus, and Bacillus pumilus from red oncom and gembus tempe; and Bacillus coagulans from shrimp paste. Research in Indonesia on fibrinolytic enzymes from fermented foods is still limited, even though Indonesia is known as a country rich in fermented food products such as tempeh, tauco, gembus tempeh, red oncom, tempoyak, jambal roti, and tuak. This research aimed to conduct a molecular study of microbial fibrinolytic enzymes from moromi fermentation products. The finding of local fibrinolytic microbes is a preliminary step that needs to be followed by further steps, and in the area of molecular is to search for information on the gene encoding fibrinolytic enzymes and their characteristics, information on the molecular mechanism of the enzyme, interactions between fibrinolytic enzymes with the fibrin and fibrinogen substrates. Utilization of tools in bioinformatics can provide various important information, especially in this molecular characteristics of the fibrinolytic enzyme. This research succeeded in isolating fibrinolytic protease producing bacteria from Indonesian fermented food, moromi. Three isolates showed proteolytic activity on skim milk agar and also showed strong fibrinolytic activity based on fibrin plate analysis. The three isolates (K1, K2, and K3) were identified using the API 50 CHB kit and the molecular identification was through the 16S rRNA gene. The results of biochemical tests using API 50 CHB kit identified isolate K1 as Bacillus cereus 1 (99.8%), K2 as Bacillus subtilis (97%), and K3 as Bacillus cereus (99%). Molecular identification based on 16S rRNA’s gene confirmed K1 as Bacillus cereus 1 (100%), K2 as Bacillus subtilis (99.86%), and K3 as Bacillus cereus (97.56%). The nucleotide sequences were deposited at GenBank, with accession number MK045762 for K1, MK652831 for K2, and MK530096 for K3. The fibrinolytic activity of extracellular enzyme from Bacillus subtilis K2 was almost similar to that of the commercial fibrinolytic enzyme, lumbrokinase originated from earthworm. Based on morphological, biochemical, and 16S rRNA gene analysis, a specific isolate with the highest proteolytic and fibrinolytic activity was identified as Bacillus subtilis K2. BLASTn analysis of the nucleotide sequence revealed 73.6% homology of the fibrinolytic gene with the gene encoding fibrin degrading enzyme Nattokinase of the Bacillus subtilis subsp. natto isolated from fermented soybean in Japan. Analysis of the putative amino acid sequence using Prosite revealed a serine protease enzyme with amino acid aspartate, histidine, and serine in the catalytic triad. Bioinformatic analysis using ProtParam revealed the Subtilisin K2 enzyme with pI of 6.02, high stability, high aliphatic index, low GRAVY value, and this enzyme appeared as a molecule of 26 kDa as confirmed also by zymogram assay. Conserved domain and motif determination of Subtilisin K2 enzyme using webserver CDART and Myhits indicated that this enzyme appeared to share conserved domain, with peptidase s8 super family also known as the subtilase family with its motif: Asp subtilase, His subtilase, and Ser subtilase. Webserver SOPMA was used to analyze the secondary structure of Subtilisin K2 which revealed that 24.52%, 24.52%, 11.49%, and 39.46% amino acid residues are present in alpha helix, beta sheets, beta turns, and random coil, respectively. Alpha helix, beta sheet, and beta turn content of Subtilisin K2 was higher than those of Nattokinase. This showed that the structure of Subtilisin K2 was different from the structure of Nattokinase, and this data also correlated with higher stability of Subtilisin K2 than Nattokinase. Webserver HADDOCK applied to molecular docking analysis between this fibrin degrading enzymes and the specific substrates (fibrin and fibrinogen) aimed to predict the mechanism of action. This analysis revealed no productive interaction between Subtilisin K2 and fibrinogen. However, hydrolysis reaction is indicated strongly between Subtilisin K2 and the fibrin substrate. Amino acid Asp19, His51, and Ser208 in the Subtilisin K2’s active site interacted with Leu168, Ile171, and Leu172 of the fibrin substrate with negative ΔG (–19.4 kcal/mol) and low Kd value (6.3E-15 M) that showed suitable substrate specificity. Subtilisin K2 tend to act more as fibrin degrading enzyme than as fibrinogen degrading enzyme.