| dc.description.abstract | Dickeya dadantii adalah bakteri fitopatogen penyebab penyakit busuk lunak
pada beberapa tanaman seperti kentang, anggrek, dan wortel. Bakteri ini dapat
memproduksi enzim pektinolitik yang mampu menghidrolisis dinding sel tanaman
sehingga jaringan tersebut melunak dan membusuk. Produksi enzim pektinolitik
pada D. dadantii diregulasi oleh mekanisme quorum sensing (QS) dengan
senyawa asil homoserin lakton (AHL) berupa 3-oxo-C6-HSL sebagai senyawa
autoinduser. Mekanisme QS merupakan mekanisme komunikasi pada bakteri
patogen Gram negatif untuk meregulasi beberapa ekspresi gen seperti
bioluminensi pada Vibrio fisheri, pembentukkan biofilm pada Pseudomonas
aeuroginosa, dan produksi pigmen violacein pada C.violaceum. Penghambatan
mekanisme QS melalui mekanisme quorum quenching (QQ) menggunakan enzim
AHL laktonase dapat digunakan sebagai salah satu alternatif dalam pengendalian
bakteri D. dadantii. Enzim tersebut dapat mendegradasi cincin lakton pada 3-oxo-
C6-HSL sehingga gen penyandi enzim pektinolitik pada D. dadantii tidak
terekspresi. Bacillus cereus B10 asal Hutan cangkuang, Sukabumi pada penelitian
sebelumnya telah dilaporkan memiliki aktivitas AHL laktonase yang tinggi dalam
mereduksi gejala busuk lunak pada umbi kentang karena infeksi D. dadantii.
Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi dan menganalisis gen aiiA
penyandi AHL laktonase dari B. cereus B10, mengekspresikan gen aiiA tersebut
pada Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS, mengkonstruksi vektor biner pembawa
gen aiiA (pCAB10) serta mengekspresikan gen aiiA pada genom kentang kultivar
Medians.
Penelitian ini dibagi menjadi 2 tahap. Tahap pertama adalah karakterisasi
gen aiiA dari B. cereus B10dan ekspresi gen tersebut pada E. coli BL21 (DE3)
pLysS. Proses karakterisasi gen aiiA dilakukan dengan mengkloning gen aiiA
mengandung situs restriksi NdeI dan BamH1 dari B. cereus B10 pada vektor
pGEM-T-Easy. Gen aiiA yang telah disubkloning tersebut kemudian digunakan
untuk mengonstruksi vektor ekspresi pET15b yang membawa gen aiiA. Plasmid
pET15b-aiiA tersebut selanjutnya ditransformasikan ke dalam sel E. coli BL21
(DE3) pLysS. Gen aiiA tersebut diekspresikan pada E. coli BL21 (DE3) pLysS
dengan menambahkan IPTG dengan beberapa konsentrasi 0.1 mM, 0.5 mM, dan 1
mM sebagai senyawa induksi. Protein AiiA selanjutnya disejajarkan dengan
bakteri penghasil AHL laktonase yang lain serta kelompok enzim metallo-β-
laktamase (glioxalase dan beta laktamase). Struktur 3D dari protein AiiA tersebut
dianalisis melalui progam swissmodel.org dan pyMOL. Tahap kedua adalah
ekspresi gen aiiA pada tanaman kultivar Medians. Gen aiiA dengan situs restriksi
NcoI dan BglI1 disubkloning pada vektor pGEM-T-Easy. Gen aiiA dikonstruksi
pada vektor pCAMBIA2300 menjadi pCAB10. Plasmid tersebut kemudian
ditransformasi ke dalam E. coli DH5α melalui teknik elektroporasi. Transformasi
pCAB10 ke dalam Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 dilakukan melalui
teknik Triparental mating (TPM). A. tumefaciens LBA 4404 pembawa pCAB10
digunakan sebagai perantara untuk mentransformasikan gen aiiA ke dalam genom
tanaman kentang kultivar Medians. Proses transformasi gen aiiA pada pCAB10
dilakukan melalui metode kokultivasi. Eksplan-eksplan yang berupa ruas batang
(internode) yang telah dikokultivasi kemudian dipindahkan ke media induksi
kalus tanpa kanamisin sebagai agen seleksi. Kalus yang tumbuh kemudian
diseleksi pada media yang mengandung 50 mg L-1 kanamisin. Tunas yang tumbuh
dari kalus pada media seleksi dinyatakan sebagai tanaman putatif transgenik.
Tanaman tersebut kemudian diperbanyak dan diseleksi ketahanannya terhadap
penyakit busuk lunak D. dadantii. Analisis ekspresi gen aiiA dilakukan dengan
mendeteksi keberadaan gen aiiA dari cDNA tanaman putatif transgenik melalui
teknik PCR.
Hasil karakterisasi gen aiiA B. cereus B10 menunjukkan bahwa gen aiiA
terdiri dari 750 bp yang menyandikan 250 asam amino dengan tingkat kesamaan
yang tinggi terhadap protein AiiA dari B. cereus lainnya. AHL laktonase tersebut
merupakan kelompok enzim metallo-β-laktamase. Motif HXHXDH merupakan
motif yang conserve pada AHL laktonase dan kelompok metallo-β-laktamase
Analisis struktur 3D dari AHL laktonase menunjukkan motif HXHXDH
merupakan daerah pengikatan ion Zn2+. Proses overekspresi gen aiiA pada
plasmid pET15b di dalam sel E. coli BL21 (DE3) pLysS berhasil dilakukan
dengan menambahkan IPTG sebagai induser. Variasi konsentasi IPTG (0.1 mM,
0.5 mM, and 1 mM) tidak menunjukkan perbedaan level ekspresi gen aiiA.
Analisis SDS PAGE menunjukkan protein AiiA dari B. cereus B10 memiliki berat
molekul 28.71 kDA. Konstruksi gen aiiA berhasil dilakukan pada vektor biner
pCAMBIA2300 (pCAB10). Vektor pCAB10 berhasil ditransformasi pada E. coli
DH5α dan A. tumefaciens LBA 4404. Daerah T-DNA yang membawa gen aiiA
pada vektor pCAB10 berhasil ditransformasi pada genom tanaman kentang
kultivar Medians dengan efisiensi transformasi sebesar 57.9% dan efisiensi
regenerasi 11.9%.
Sebanyak 4 klon tanaman putatif transgenik (Mahl1, Mahl2, Mahl3, dan
Mahl4) memiliki ketahanan yang lebih tinggi terhadap D. dadantii dibandingkan
dengan tanaman non transgenik. Frekuensi terjadinya penyakit pada klon putatif
transgenik yang terserang penyakit berkisar antara 7.1%-21.4% dan Persentase
penekanan penyakit busuk lunak berkisar 78.57-92.85%. Klon Mahl1 memiliki
ketahanan paling tinggi terhadap D. dadantii dengan frekuensi penyakit sebesar
7.1% dan persentase penekanan penyakit busuk lunak sebesar 92.85%. Gen aiiA
dari cDNA 4 tanaman putatif transgenik berhasil teramplifikasi dengan ukuran
750 bp, sedangkan amplikon gen aiiA dari cDNA non transforman (kontrol) tidak
teramplifikasi. Introduksi gen aiiA pada genom tanaman kentang kultivar Medians
berhasil memberikan ketahanan kentang kultivar Medians terhadap penyakit
busuk lunak yang disebabkan D. dadantii. Hasil penelitian ini dapat menambah
informasi mengenai pengendalian penyakit busuk lunak dengan pendekatan
mekanisme QQ. | id |
