Perakitan Tanaman Kentang Kultivar Medians yang Membawa Gen Penyandi AHL Laktonase untuk Meningkatkan Ketahanan terhadap Penyakit Busuk Lunak

Abstract

Dickeya dadantii adalah bakteri fitopatogen penyebab penyakit busuk lunak pada beberapa tanaman seperti kentang, anggrek, dan wortel. Bakteri ini dapat memproduksi enzim pektinolitik yang mampu menghidrolisis dinding sel tanaman sehingga jaringan tersebut melunak dan membusuk. Produksi enzim pektinolitik pada D. dadantii diregulasi oleh mekanisme quorum sensing (QS) dengan senyawa asil homoserin lakton (AHL) berupa 3-oxo-C6-HSL sebagai senyawa autoinduser. Mekanisme QS merupakan mekanisme komunikasi pada bakteri patogen Gram negatif untuk meregulasi beberapa ekspresi gen seperti bioluminensi pada Vibrio fisheri, pembentukkan biofilm pada Pseudomonas aeuroginosa, dan produksi pigmen violacein pada C.violaceum. Penghambatan mekanisme QS melalui mekanisme quorum quenching (QQ) menggunakan enzim AHL laktonase dapat digunakan sebagai salah satu alternatif dalam pengendalian bakteri D. dadantii. Enzim tersebut dapat mendegradasi cincin lakton pada 3-oxo- C6-HSL sehingga gen penyandi enzim pektinolitik pada D. dadantii tidak terekspresi. Bacillus cereus B10 asal Hutan cangkuang, Sukabumi pada penelitian sebelumnya telah dilaporkan memiliki aktivitas AHL laktonase yang tinggi dalam mereduksi gejala busuk lunak pada umbi kentang karena infeksi D. dadantii. Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi dan menganalisis gen aiiA penyandi AHL laktonase dari B. cereus B10, mengekspresikan gen aiiA tersebut pada Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS, mengkonstruksi vektor biner pembawa gen aiiA (pCAB10) serta mengekspresikan gen aiiA pada genom kentang kultivar Medians. Penelitian ini dibagi menjadi 2 tahap. Tahap pertama adalah karakterisasi gen aiiA dari B. cereus B10dan ekspresi gen tersebut pada E. coli BL21 (DE3) pLysS. Proses karakterisasi gen aiiA dilakukan dengan mengkloning gen aiiA mengandung situs restriksi NdeI dan BamH1 dari B. cereus B10 pada vektor pGEM-T-Easy. Gen aiiA yang telah disubkloning tersebut kemudian digunakan untuk mengonstruksi vektor ekspresi pET15b yang membawa gen aiiA. Plasmid pET15b-aiiA tersebut selanjutnya ditransformasikan ke dalam sel E. coli BL21 (DE3) pLysS. Gen aiiA tersebut diekspresikan pada E. coli BL21 (DE3) pLysS dengan menambahkan IPTG dengan beberapa konsentrasi 0.1 mM, 0.5 mM, dan 1 mM sebagai senyawa induksi. Protein AiiA selanjutnya disejajarkan dengan bakteri penghasil AHL laktonase yang lain serta kelompok enzim metallo-β- laktamase (glioxalase dan beta laktamase). Struktur 3D dari protein AiiA tersebut dianalisis melalui progam swissmodel.org dan pyMOL. Tahap kedua adalah ekspresi gen aiiA pada tanaman kultivar Medians. Gen aiiA dengan situs restriksi NcoI dan BglI1 disubkloning pada vektor pGEM-T-Easy. Gen aiiA dikonstruksi pada vektor pCAMBIA2300 menjadi pCAB10. Plasmid tersebut kemudian ditransformasi ke dalam E. coli DH5α melalui teknik elektroporasi. Transformasi pCAB10 ke dalam Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 dilakukan melalui teknik Triparental mating (TPM). A. tumefaciens LBA 4404 pembawa pCAB10 digunakan sebagai perantara untuk mentransformasikan gen aiiA ke dalam genom tanaman kentang kultivar Medians. Proses transformasi gen aiiA pada pCAB10 dilakukan melalui metode kokultivasi. Eksplan-eksplan yang berupa ruas batang (internode) yang telah dikokultivasi kemudian dipindahkan ke media induksi kalus tanpa kanamisin sebagai agen seleksi. Kalus yang tumbuh kemudian diseleksi pada media yang mengandung 50 mg L-1 kanamisin. Tunas yang tumbuh dari kalus pada media seleksi dinyatakan sebagai tanaman putatif transgenik. Tanaman tersebut kemudian diperbanyak dan diseleksi ketahanannya terhadap penyakit busuk lunak D. dadantii. Analisis ekspresi gen aiiA dilakukan dengan mendeteksi keberadaan gen aiiA dari cDNA tanaman putatif transgenik melalui teknik PCR. Hasil karakterisasi gen aiiA B. cereus B10 menunjukkan bahwa gen aiiA terdiri dari 750 bp yang menyandikan 250 asam amino dengan tingkat kesamaan yang tinggi terhadap protein AiiA dari B. cereus lainnya. AHL laktonase tersebut merupakan kelompok enzim metallo-β-laktamase. Motif HXHXDH merupakan motif yang conserve pada AHL laktonase dan kelompok metallo-β-laktamase Analisis struktur 3D dari AHL laktonase menunjukkan motif HXHXDH merupakan daerah pengikatan ion Zn2+. Proses overekspresi gen aiiA pada plasmid pET15b di dalam sel E. coli BL21 (DE3) pLysS berhasil dilakukan dengan menambahkan IPTG sebagai induser. Variasi konsentasi IPTG (0.1 mM, 0.5 mM, and 1 mM) tidak menunjukkan perbedaan level ekspresi gen aiiA. Analisis SDS PAGE menunjukkan protein AiiA dari B. cereus B10 memiliki berat molekul 28.71 kDA. Konstruksi gen aiiA berhasil dilakukan pada vektor biner pCAMBIA2300 (pCAB10). Vektor pCAB10 berhasil ditransformasi pada E. coli DH5α dan A. tumefaciens LBA 4404. Daerah T-DNA yang membawa gen aiiA pada vektor pCAB10 berhasil ditransformasi pada genom tanaman kentang kultivar Medians dengan efisiensi transformasi sebesar 57.9% dan efisiensi regenerasi 11.9%. Sebanyak 4 klon tanaman putatif transgenik (Mahl1, Mahl2, Mahl3, dan Mahl4) memiliki ketahanan yang lebih tinggi terhadap D. dadantii dibandingkan dengan tanaman non transgenik. Frekuensi terjadinya penyakit pada klon putatif transgenik yang terserang penyakit berkisar antara 7.1%-21.4% dan Persentase penekanan penyakit busuk lunak berkisar 78.57-92.85%. Klon Mahl1 memiliki ketahanan paling tinggi terhadap D. dadantii dengan frekuensi penyakit sebesar 7.1% dan persentase penekanan penyakit busuk lunak sebesar 92.85%. Gen aiiA dari cDNA 4 tanaman putatif transgenik berhasil teramplifikasi dengan ukuran 750 bp, sedangkan amplikon gen aiiA dari cDNA non transforman (kontrol) tidak teramplifikasi. Introduksi gen aiiA pada genom tanaman kentang kultivar Medians berhasil memberikan ketahanan kentang kultivar Medians terhadap penyakit busuk lunak yang disebabkan D. dadantii. Hasil penelitian ini dapat menambah informasi mengenai pengendalian penyakit busuk lunak dengan pendekatan mekanisme QQ.