Pemetaan Genetik dan Identifikasi Gen Toleransi Kekeringan pada Tanaman Padi

Abstract

Respon toleransi kekeringan pada tanaman padi merupakan sifat kompleks hasil kontribusi dari berbagai karakter agromorfofisiologi yang dikendalikan oleh sejumlah gen dan diwariskan secara kuantitatif sebagai quantitative trait loci (QTL). Eksplorasi QTL untuk sifat toleransi kekeringan menggunakan sumber daya genetik baru dapat bermanfaat untuk mempelajari mekanisme yang mendasari sifat tersebut. Penelitian ini menggunakan populasi recombinant inbred line (RIL) padi keturunan F9 silangan IR64 × Hawara Bunar sebagai sumber daya genetik baru untuk melakukan pemetaan QTL dan identifikasi gen yang bertanggung jawab pada toleransi cekaman kekeringan terkait sifat agromorfofisiologi pada tanaman padi. Studi genetik diawali dengan melakukan sekuensing genom 90 padi RIL berikut kedua tetuanya. Identifikasi marka SNP dan konstruksi peta genetik pada 12 kromosom padi dilakukan sebagai karakterisasi genotipe. Karakterisasi fenotipe secara paralel dilakukan untuk karakter morfofisiologi dan agrofisiologi pada percobaan yang berbeda. Karakter morfofisiologi terkait toleransi cekaman kekeringan diamati secara simultan pada fase vegetatif di dalam rumah kaca menggunakan sistem pemrosesan morfometri dan instrumen Li-Cor 6400. Karakterisasi fenotipe juga dilakukan pada karakter agrofisiologi fase reproduktif yang dilakukan pada kondisi lapangan. Asosiasi genotipe-fenotipe berbasis populasi bi-parental dilakukan sebagai upaya dalam menentukan daerah QTL dan mengidentifikasi gen untuk karakter terkait toleransi kekeringan pada tanaman padi. Tingkat ekspresi gen-gen di dalam daerah QTL tersebut selanjutnya dikuantifikasi berdasarkan meta-analisis transkriptom. Gen responsif kekeringan mayor juga diidentifikasi berdasarkan meta-analisis transkriptom. Peta genetik yang digunakan untuk analisis QTL dikonstruksi dari marka hasil sekuensing. Genom 90 galur populasi RIL beserta kedua tetuanya disekuen menggunakan teknik genotyping-by-sequencing dan dihasilkan 30,3 juta basa dengan kualitas baik. Total sebanyak 4 juta marka SNP dihasilkan dari pensejajaran sekuen genom RIL beserta tetuanya. Marka tersebut diseleksi sehingga diperoleh 55.205 SNP berkualitas tinggi. Peta genetik sepanjang 1980 cM dengan kerapatan rata-rata sebesar 2,27 cM pada 12 kromosom tanaman padi telah berhasil dikonstruksi menggunakan 55.205 marka SNP, yang diwakili oleh 873 marka BIN. Peta genetik berikut dengan informasi konstitusi genetik dari setiap galur populasi RIL pada tahap ini selanjutnya digunakan untuk analisis QTL. Analisis QTL untuk karakter morfofisiologi dan agrofisiologi tanaman padi masing-masing dilakukan pada fase vegetatif dan reproduktif di bawah kondisi cekaman kekeringan. Karakter morfologi yang diamati yaitu luas daun, jumlah daun, panjang tajuk dan akar, berikut nilai rasionya. Karakter fisiologi yang diamati yaitu terkait fotosintesis, transpirasi, konduktansi stomata, CO2 interseluler, efisiensi penggunaan air, suhu tajuk, dan parameter Ball-Berry. Karakter agronomi yang diamati yaitu terkait hasil dan komponen hasil, yang meliputi jumlah malai, jumlah anakan, dan tinggi tanaman. Karakter agromorfofisiologi dianalisis dari pengamatan langsung pada kondisi kontrol dan cekaman kekeringan, berikut dengan karakter kondisional yang diperoleh dari perhitungan lima indeks toleransi, menghasilkan 175 kombinasi karakter morfofisiologi dan 147 kombinasi karakter agrofisiologi. Analisis pemetaan interval komposit berhasil mendeteksi 159 QTL untuk karakter morfofisiologi di dalam 52 daerah pada 12 kromosom tanaman padi. Sebanyak 4 QTL hotspot dan 1 QTL mayor untuk karakter morfofisiologi terpetakan pada kromosom padi nomor 1, 4 dan 11. Total 154 QTL untuk karakter agrofisiologi yang teridentifikasi, terdistribusi pada 66 daerah di dalam 12 kromosom padi. Satu daerah QTL hotspot berasosiasi dengan sejumlah karakter agrofisiologi toleransi kekeringan berhasil dipetakan pada kromosom nomor 8. Profil ekspresi pada gen-gen di dalam daerah QTL untuk karakter agromorfofisiologi terkait kekeringan dipelajari lebih dalam melalui studi meta-analisis transkriptom. Sebanyak 106 sekuen transkriptom terkait cekaman kekeringan pada tanaman padi dianalisis dari 5 studi yang berbeda. Pra-pemrosesan dan analisis ekspresi gen diferensial dilakukan secara simultan pada seluruh data sampel. Analisis fungsional ontologi gen dilakukan secara kuantitatif pada kategori proses biologis, fungsi molekuler, dan komponen seluler pada gen-gen yang signifikan mengalami perubahan tingkat ekspresi. Total sebanyak 33 dan 75 kandidat gen toleransi yang masing-masing berasosiasi dengan karakter morfofisiologi dan agrofisiologi mengalami perubahan tingkat ekspresi pada perlakuan cekaman kekeringan berdasarkan studi meta-analisis transkriptom. Sejumlah gen tersebut mayoritas berperan dalam proses dan fungsi regulasi, pensinyalan, dan transportasi. Berdasaran kombinasi dua analisis QTL dan studi profil transkriptom, sebanyak tiga gen di antaranya pada lokus Os01g0200600, Os01g0200300, dan Os01g0198000 memiliki potensi yang tinggi sebagai kandidat gen toleransi kekeringan pada tanaman padi. Pengerucutan untuk mengidentifikasi gen toleransi kekeringan mayor yang berfungsi dalam regulasi dan dapat memodulasi kerja gen lain masih perlu dilakukan. Meta-analisis jejaring korelasi terboboti pada data transkriptom diaplikasikan pada gen yang mengalami perbedaan tingkat ekspresi pada kondisi kekeringan. Pemrosesan sekuen, analisis ekspresi gen diferensial, dan korelasi terboboti dilakukan untuk membentuk modul ekspresi. Sejumlah 7 gen responsif kekeringan mayor yang dimodulasi dengan pola ekspresi berbeda telah teridentifikasi pada kromosom 1, 2, 4, 9, dan 12. Satu gen di antaranya pada lokus Os01g0863300 telah dikonfirmasi berasosiasi dengan karakter agromorfofisiologi terkait toleransi cekaman kekeringan pada populasi RIL IR64 × Hawara Bunar. Sejumlah QTL untuk karakter agromorfofisiologi terkait kekeringan yang dilaporkan pada penelitian ini, terutama pada daerah QTL hotspot dapat diaplikasikan untuk pemuliaan berbantuan marka. Marka SNP yang terpaut erat dengan target QTL dapat dikonversi menjadi marka berbasis PCR, sehingga dapat mempermudah penerapannya dalam introgresi. Kandidat gen toleransi kekeringan yang teridentifikasi pada penelitian ini dapat membuka topik-topik penelitian dasar, khususnya tentang karakterisasi dan analisis fungsional gen, yang bermanfaat dalam pengembangan ilmu pengetahuan. Gen-gen yang telah terkonfirmasi fungsi dan mekanisme kerjanya dapat diaplikasikan melalui teknologi DNA rekombinan atau pengeditan genom untuk perbaikan genetik padi toleran cekaman kekeringan.

Drought tolerance in rice are contributed by various agro-morpho-physiological traits, controlled by several genes, and quantitatively inherited as a quantitative trait locus (QTL). The QTL exploration of drought-tolerant traits using novel genetic resources could be useful for dissecting the mechanisms that underlie the complexity of these traits. This study used the recombinant inbred line (RIL) population derived from rice IR64 × Hawara Bunar as novel genetic resources to perform QTL mapping and to identify genes responsible for drought stress tolerance related to agro-morpho-physiological traits in rice. The genetic study was initiated by conducting genome sequencing of 90 lines of RIL and rice var. IR64 and Hawara Bunar as the parental lines. Identification of high-quality SNP markers and construction of high-density genetic maps on 12 rice chromosomes were performed as genotype characterization. Parallel phenotype characterization was performed for morpho-physiological and agro-physiological traits in different experiments. The morpho-physiological traits related to drought tolerance were observed simultaneously in the vegetative stage in the greenhouse using a morphometric processing system and the Li-Cor 6400 instrument. Phenotype characterization was also performed on the agro-physiological traits of the reproductive stage carried out in field conditions. Bi-parental population-based genotype-phenotype association was performed to map the QTL region and identify genes for drought tolerance related traits in rice. The level of expression of genes in the QTL region was quantified based on transcriptome meta-analysis. The major drought-responsive genes were also identified based on the transcriptome meta-analysis and integrated with the QTL region. The genetic map used for QTL analysis was constructed from the sequence-based markers. The genomes of 90 lines of RIL population and their parents were sequenced using genotyping-by-sequencing techniques, produced good quality 30,3 million bases. A total of 4 million SNP markers were produced from the alignment of the RIL genome sequence and its parents. These markers were filtered to obtain 55.205 high-quality SNPs. A genetic map of 1980 cM with an average density of 2,27 cM on 12 rice chromosomes was successfully constructed using SNP markers, represented by 873 BIN markers. The genetic map and the genetic constitution information of each RIL were then used for QTL analysis. QTL analysis for morpho-physiological and agro-physiological traits of rice was carried out at the vegetative and reproductive stages, respectively, under drought stress conditions. Morphological traits observed were leaf area, leaf number, shoot and root length. The physiological traits observed were related to photosynthesis, transpiration, stomatal conductance, intercellular CO2, water use efficiency, shoot temperature, and Ball-Berry parameters. The agronomic traits observed were yield and yield-related traits, including the panicles number, tillers number, and plant height. The agro-morpho-physiological traits were directly observed on the control and drought stress, along with the conditional characters obtained from the calculation of the five tolerance indices, resulting in 175 combinations of morpho-physiological traits and 147 combinations of agro-physiological traits. Composite interval mapping analysis successfully detected 159 QTL for morpho-physiological traits in 52 regions on 12 rice chromosomes. A total of 4 hotspots QTL and 1 major QTL for morpho-physiological traits were mapped on rice chromosomes 1, 4, and 11. A total of 154 QTL for agro-physiological traits, distributed in 66 regions on 12 rice chromosomes. One hotspot QTL region associated with several agro-physiological traits were mapped on chromosome 8. The expression profile of genes within the QTL region for drought-related agro-morpho-physiological traits was investigated through transcriptome meta-analysis. A total of 106 transcriptome sequences related to drought stress in rice were analyzed from 5 different studies. Preprocessing and differential gene expression analysis was performed simultaneously on all data samples. The gene ontology-based functional analysis was performed quantitatively on the categories of biological processes, molecular functions, and cellular components at the significant differentially expressed genes. A total of 33 and 75 tolerance candidate genes associated with morpho-physiological and agro-physiological traits, respectively, were differentially expressed under drought stress treatment. The majority of these genes play a role in the processes and functions of regulation, signaling, and transportation. Based on the combination of two QTL analyzes and transcriptome profile studies, three genes of which at loci Os01g0200600, Os01g0200300, and Os01g0198000 have high potential as candidates for drought tolerance genes in rice. Narrowing-down the gene list was performed to identify major drought tolerance genes that function in the regulation and modulation of other genes. A weighted correlation network meta-analysis of transcriptome data was applied to differentially expressed genes under drought conditions. Sequence processing, differential gene expression analysis, and weighted correlation were performed to build the expression module. A total of 7 major drought-responsive genes modulated differently were identified on chromosomes 1, 2, 4, 9, and 12. A gene at locus Os01g0863300 was confirmed to be associated with agro-morpho-physiological traits related to drought tolerance in the IR64 × Hawara Bunar RIL population. A number of QTL for drought-related agro-morpho-physiological traits reported in this study, particularly in hotspot QTL regions could be applied in marker-assisted breeding. SNP markers that are closely linked to the QTL target can be converted into PCR-based markers to facilitate genetic introgression. The drought tolerance gene candidates identified in this study could stimulate the development of basic research, particularly in gene characterization and functional analysis. The well-characterized genes could be applied for genetic improvement of drought-tolerant rice through recombinant DNA technology or genome editing.