Potensi Ekstrak Sarang Burung Walet (Collocalia fuciphaga) Sebagai Anti Aging Pada Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

Abstract

Penuaan menyebabkan hilangnya kemampuan jaringan secara progresif untuk pulih dari stress yang mengarah pada peningkatan insiden penyakit degeneratif kronis. Hilangnya homeostasis jaringan sebagian dipicu oleh peningkatan penuaan sel dan penurunan fungsi stem cell yang mengakibatkan berbagai penyakit terkait usia seperti osteoporosis, ginjal kronis, diabetes, neurodegenerasi dan kanker. Berbagai terapi dan intervensi berbasis stem cell maupun intervensi diet dan farmakologis lainnya yang menginduksi regenerasi dan rejuvenasi stem cell dimungkinkan menjadi hal yang sangat penting untuk meningkatkan rentang kesehatan dimasa yang akan datang. Pada penelitian ini dilakukan intervensi menggunakan ekstrak sarang burung walet atau yang biasa disebut edible bird’s nest (EBN) terhadap penuaan bone marrow mesenchymal stem cell (BMMSC). EBN telah lama dikenal sebagai bahan pangan kaya nutrisi dan senyawa bioaktif yang bermanfaat bagi kesehatan. Namun, bukti ilmiah akan klaim manfaat EBN bagi kesehatan masih sedikit dilaporkan. Disamping itu, meskipun Indonesia sebagai negara penghasil dan pengekspor EBN terbesar didunia, namun penelitian ilmiah terkait manfaatnya bagi kesehatan masih belum banyak dilakukan. Penelitian ini dibagi menjadi empat tahap, pada tahap pertama dilakukan analisis terhadap profil nutrisi EBN yang meliputi analisis proksimat, asam amino, nitrit dan nitrat serta karakteristik protein dari beberapa wilayah di Indonesia. Hasil analisis menunjukkan bahwa kandungan nutrisi EBN yang dikoleksi dari beberapa wilayah di Indonesia berbeda-beda. Urutan kandungan nutrisi EBN dari besar ke kecil adalah protein >karbohidrat >air >abu > lemak. Protein merupakan kandungan terbesar EBN dengan kadar 53,09-56,25%. Beberapa studi melaporkan bahwa efek farmakologi EBN diperoleh dari komponen protein. Berdasarkan data studi ini diketahui bahwa EBN asal Sumatera Barat (WS) memiliki kadar protein tertinggi (56,25%) dibandingkan dengan daerah lainnya. Oleh karena itu EBN asal daerah WS dipilih untuk analisis lebih lanjut terkait aktivitasnya sebagai anti aging pada BMMSC. Pada tahap kedua, dilakukan karakterisasi dan ekspansi BMMSC jangka panjang secara in vitro. Karakterisasi BMMSC dilakukan dengan metode immunophenotyping, dan hasil karakterisasi menunjukkan bahwa stem cell yang digunakan telah memenuhi kriteria yang ditetapkan oleh International Society for Cellular Therapy (ISCT) untuk mesenchymal stem cell. Ekspansi jangka panjang BMMSC secara in vitro dilakukan untuk membuat stem cell menua yang akan digunakan sebagai model penuaan in vitro dengan menganalisis ekspresi biomarker penuaan pada level seluler (SA--Gal) dan level molekuler (p16INK4a). Penuaan BMMSC pada penelitian ini teramati mulai pada pasase 5 (P5) yang ditandai dengan meningkatnya ekspresi marker penuaan SA--Gal dan p16INK4a secara signifikan dibandingkan dengan BMMSC pada pasase awal (P3) (p<0,05). Pada tahap ketiga, dilakukan analisis pengaruh ekstrak EBN terhadap viabilitas, proliferasi dan ekspresi marker penuaan SA--Gal dan p16INK4a. BMMSC dibagi dalam empat kelompok eksperimen, yaitu kelompok kontrol, kelompok yang diperlakukan dengan EGF 10 ng/mL (sebagai referensi), kelompok yang diperlakukan dengan ekstrak EBN 50 ppm dan kelompok yang diperlakukan dengan ekstrak EBN 200 ppm. Hasil analisis menunjukkan bahwa kelompok BMMSC yang diperlakukan dengan ekstrak EBN mampu mereduksi ekspresi marker penuaan SA--Gal dan p16INK4a pada penuaan awal (P5) maupun penuaan lanjut BMMSC (P8) secara signifikan dibandingkan kelompok kontrol (p<0,05). Perlakuan dengan ekstrak EBN 200 ppm menunjukkan penurunan ekspresi marker penuaan yang paling besar dibandingkan kelompok eksperimen lainnya. Konsekuensi dari penurunan ekspresi marker penuaan teramati dengan meningkatnya kapasitas viabilitas dan proliferasi pada BMMSC yang menua. Pada P5, BMMSC yang diperlakukan dengan ekstrak EBN 200 ppm mampu meningkatkan proliferasi BMMSC (26,7%) secara signifikan dibandingkan dengan kelompok kontrol (p<0,05), dan pada P8 BMMSC, meskipun tidak terjadi peningkatan kapasitas proliferasi, namun perlakuan dengan ekstrak EBN mampu meningkatkan viabilitas BMMSC yang menua secara signifikan dibandingkan kelompok kontrol (p<0,05). Pada tahap akhir, dilakukan studi mekanisme pada level molekuler untuk untuk mengetahui mekanisme yang mendasari aktivitas anti aging ekstrak EBN terhadap BMMSC, khususnya terhadap jalur yang berhubungan dengan inflamasi. Hasil analisis menunjukkan bahwa ekstrak EBN mampu menurunkan level ekspresi mRNA IL-6 BMMSC secara signifikan dibandingkan dengan kelompok kontrol (p<0,05). Hasil ini mengindikasikan bahwa ekstrak EBN mampu menghambat produksi pro-inflamasi sitokin yang berkontribusi terhadap penuaan sel. Penurunan ekspresi gen IL-6 ini diduga terkait dengan penurunan ekspresi faktor transkripsi NF-κB. Jalur persinyalan NF-B dikenal sebagai proses kunci yang mendasari inflamasi. Pada studi ini ditemukan bahwa level ekspresi mRNA NF-B dari BMMSC menurun secara signifikan (p<0,05) setelah diperlakukan dengan ekstrak EBN 200 ppm. Studi ini mengindikasikan ada korelasi antara faktor transkripsi NF-κΒ, ekspresi IL-6 dan penuaan. Namun karena jalur persinyalan NF-κΒ merupakan suatu proses komplek yang melibatkan banyak molekul, perlu dilakukan investigasi lebih lanjut untuk mengelusidasi mekanisme ekstrak EBN dalam menunda/ memperlambat penuaan BMMSC. Dengan demikian, data penelitian ini mengindikasikan bahwa ekstrak EBN memiliki potensi sebagai anti aging pada BMMSC dengan mereduksi ekspresi marker penuaan SA-β-Gal dan p16INK4a melalui jalur inflamasi dengan menekan ekspresi mRNA mediator proinflamasi IL-6 melalui penurunan ekspresi faktor transkripsi NF-κB.

Aging causes a progressive loss of tissue's ability to recover from stress leading to an increased incidence of chronic degenerative diseases. The loss of tissue homeostasis is partly triggered by an increase in cell aging and a decrease in stem cell function resulting in various age-related diseases such as osteoporosis, chronic kidney disease, diabetes, neurodegenerative diseases and cancer. Various stem cell based treatments and interventions as well as other dietary and pharmacological interventions that induce stem cell regeneration and rejuvenation may be very important to extending of lifespan and improve human health in the future. In this study, an intervention of edible bird nest (EBN) extract against aging process of bone marrow mesenchymal stem cell (BMMSC) was performed. EBN has been known as a food ingredient with rich in nutrients and bioactive compounds that are beneficial for health. However, scientific evidence of the claims of its benefits for human health is still limited. In addition, even though Indonesia is the largest EBN producing and exporting country in the world, scientific research related to its health benefits has not been widely carried out. This research is divided into four stages. In the first stage, an analysis of the EBN nutritional profile which includes analysis of proximate, amino acids, nitrites and nitrates as well as protein characteristics of EBN from several regions in Indonesia (West Sumatra, South Sumatra, West Java, West Kalimantan, Central Sulawesi and Southeast Sulawesi) was carried out. The results showed that the nutritional content of the EBN collected from several regions in Indonesia varies. The order of EBN nutrient content, from large to small, was protein> carbohydrates> water> ash> fat. Protein was the largest content of EBN with concentration of 53.09-56.25%. A number of studies reported that the pharmacological effects of EBN were derived from the protein content. From this study, it was found that EBN from West Sumatra has the highest protein content (56.25%) compared to other regions. Therefore, EBN from the West Sumatra was chosen for further analysis related to its activity as anti-aging in BMMSC. In the second stage, characterization and long-term expansion in vitro of the BMMSC was carried out. Characterization was carried out by immunophenotyping, and the results showed that BMMSC used in this study had met the criteria set by The International Society for Cellular Therapy for mesenchymal stem cells. Long-term expansion of BMMSC was carried out to produce aged BMMSC which will be used as an in vitro aging model, as characterized by analyzing the expression of aging biomarkers SA--Gal and p16INK4a. Aging of BMMSC in this study was observed starting at passage 5 (P5) which was indicated by the significantly increased expression of aging markers SA--Gal and p16INK4a compared to BMMSC in early passage (P3) (p <0.05). In the third stage of the research, an analysis of the effect of EBN extracts on BMMSC proliferation, viability and expression of aging markers SA--Gal and p16INK4a was carried out. BMMSCs were divided into four experimental groups, namely the control group, the group treated with EGF 10 ng / mL (as reference), the group treated with EBN extract 50 ppm, and the group treated with 200 ppm EBN extract. The analysis showed that the BMMSC groups treated with EBN extract were able to significantly reduce the expression of aging markers SA--Gal and p16INK4a in BMMSCs both in early stage of aging (P5) and late stage of aging (P8), compared to control (p <0.05). Treatment with 200 ppm EBN extract showed the greatest reduction in expression of aging markers compared to other experimental groups. The consequence of decreasing expression of aging markers was observed in the increased viability and proliferation capacity of BMMSC. At P5, treatment of BMMSC with 200 ppm EBN extract was able to significantly increase BMMSC proliferation (26.7%) compared to the control group (p <0.05). At P8 BMMSC, although there was no increase in proliferation capacity, treatment of BMMSC with EBN extract was able to significantly increase the viability of BMMSC compared to the control group (p <0.05). In the last stage of this research, a mechanism study at the molecular level was carried out to determine the mechanism underlying the anti-aging activity of EBN extracts against BMMSC, especially against pathways associated with inflammation. The analysis showed that the EBN extract was able to significantly reduce the IL-6 mRNA expression level compared to the control group (p <0.05). These results indicate that the EBN extract was able to inhibit the production of pro-inflammatory cytokines that contribute to BMMSC aging. This decrease in IL-6 gene expression is thought to be associated with decreased expression of the transcription factor NF-κB. The NF-κB signaling pathway is recognized as a key process underlying inflammation. In this study it was found that the expression level of NF-κB mRNA in aged BMMSC was decreasing significantly (p <0.05) after treatment with 200 ppm EBN extract. This study indicates a correlation between transcription factor NF-κΒ, IL-6 expression and aging. However, because NF-κΒ signaling is a complex process involving many molecules, further investigations are needed to elucidate the mechanism of EBN extract in delaying or slowing down the aging of BMMSC. Thus, the data of this study indicate that EBN extract has potential as anti-aging in BMMSC by reducing the expression of aging markers SA-β-Gal and p16INK4a through the inflammatory pathway by suppressing the expression of the proinflammatory mediator IL-6 mRNA through decreased expression of the transcription factor NF-κB.